Optimierung des Bioprozesses für kultiviertes Fleisch

Das Zellkulturmedium ist der bedeutendste Kostentreiber für die Kulturfleischproduktion. Die Optimierung des Designs und der Instrumentierung von Bioreaktoren durch zus?tzliche ?berwachungsfunktionen mittels Sensoren kann dazu beitragen, diese Kosten zu senken und eine maximale Zellproduktionskapazit?t pro Einheit mittleren Volumens zu erreichen.
Scale-Down-Ans?tze werden seit langem in der Bioverarbeitung angewendet, um Scale-Up-Probleme zu l?sen. Miniaturisierte Bioreaktoren haben sich als Instrument zur Gewinnung prozessrelevanter Daten in der frühen Prozessentwicklung bew?hrt. Wir haben dieses Prinzip , d. h. den "Lab-on-a-Chip"-Ansatz (LoC) bei der Entwicklung einer neuen Generation kostengünstiger Sensoren zur ?berwachung verschiedener Zellkulturparameter wie Biomasse, Ammoniak und Glutamin in Zellkulturmedien angewendet.
Wir haben unsere ma?geschneiderten mikrofluidischen Bioreaktoren verwendet, die mit unserem impedimetrischen Sensor und einem optischen Sensor in Kombination mit den von PreSens bereitgestellten SensorPlugs für O₂, CO₂ und pH erg?nzt wurden. Die Hauptidee unseres Projekts war es, herauszufinden, welche Prozesse im mikrofluidischen Bioreaktor ablaufen, und die Auswirkungen auf das Zellverhalten, die Lebensf?higkeit der Zellen und die Wirksamkeit der Reagenzien zu quantifizieren. Wir haben die Wirksamkeit von PreSens SensorPlugs zur ?berwachung von Bakterien- und S?ugetierzellkulturen in mikrofluidischen Bioreaktoren getestet. Darüber hinaus führten wir eine Reihe von Pilotversuchen mit menschlichem Speichel durch, um die Anwendung der Sensoren zur Geschmacksbewertung des Endprodukts des kultivierten Fleisch-Bioprozesses weiter auszubauen. Hier werden unsere Ergebnisse für die ?berwachung der Bakterienkultur gezeigt.

Die mehrschichtigen MB-Chips wurden aus den transparenten und biokompatiblen Materialien Glas und PMMA hergestellt. Die obere und die mittlere Schicht bestanden aus PMMA und die Verbindungsschichten wurden unter Verwendung von doppelseitigen 3M-Klebeb?ndern (3M GPT-020F, St. Paul, MN 55144-1000, Minneapolis, USA) hergestellt. Die untere Schicht des Chips für die Zellkultur bestand aus Glas, auf die der Impedanzsensor mit dem piezokontrollierten Tintenstrahldruckers Fuji Dimatix DMP-3000 und der handelsüblichen Agfa-Gevaert N.V.-Nanosilbertinte mit 15 % Ag-Nanopartikeln und der leitf?higen Tinte gedruckt wurde. Der Sensor wurde mit einer dünnen Schicht SU-8 3000 Microchem Resist bedeckt. Die oberste Schicht enthielt Einlass- / Auslassl?cher, deren Durchmesser zum Pipettieren der Probe w?hrend des Füllens des Chips angepasst waren. Zus?tzlich wurden drei L?cher mit einem Durchmesser von 2,1 mm in die oberste Schicht zur Montage der PreSens SensorPlugs gemacht. Die Sensoren standen durch die L?cher in direktem Kontakt mit der Probe, was eine Echtzeitmessung der Parameter in der Probe erm?glichte. Das in der mittleren Schicht des Chips hergestellte Reservoir hatte ein Volumen von 1,8 mm für die Probe. Eine ?bernachtkultur von E. coli wurde durch Auss?en von Bakterien in Trypton-Soja-Brühe hergestellt. Danach wurde eine ?bernachtkultur zur Herstellung von 0,5 McFarlan E. coli-Kultur (1,5 × 10 KBE/ml) verwendet, die zur Kultivierung im MB diente. Wir haben den Chip zusammen mit den PreSens Sensoren im mikrobiologischen Inkubator bei 37 ° C belassen (Abb. 1).

Die Messergebnisse von O₂, CO₂ und pH w?hrend der Kultivierung von E. coli im Mikrofluidik-Chip sind in Abbildung 2 dargestellt. pH-Messungen (Abb. 2a) ergaben erwartete Ergebnisse w?hrend der Kultivierung von E. coli für 3 Stunden. Nach der anf?nglichen Lagphase treten Bakterien in eine exponentielle Wachstumsphase ein, die durch die Zellverdopplungsrate, d. h. die Generationszeit, gekennzeichnet ist. Die Generationszeiten für E. coli-Bakterien variieren im Labor zwischen 15 - 20 Minuten bis hin zu 40 Minuten. Daher wurde die Konzentration von E. coli-Bakterien zu Beginn und am Ende der Experimente unter Verwendung eines H?mozytometers bestimmt. Abbildung 3 zeigt eine Vergr??erung des H?mozytometers, das Quadrat, in dem die Zelleinheiten gez?hlt werden. 10 ?l wurden mit einer Mikropipette gewogen und auf ein H?mozytometer gegeben. Wenn die Gesamtzahl der Zelleinheiten in allen Quadraten gez?hlt wurde, wurde der Mittelwert berechnet und die Gesamtkonzentration auf dem Chip bestimmt. Das Z?hlen der Bakterien wurde unter Verwendung eines optischen Mikroskops durchgeführt. Die Anzahl der Bakterien stieg fast um das 13-fache. Abbildung 2 zeigt, dass der anf?ngliche pH-Wert (als wir die Bakterienkultur innerhalb des Mikrofluidik-Chips ausges?t haben) bei t = 0 min etwa 7,3 betrug. Nach drei Stunden beobachteten wir eine Ans?uerung der Bakterienkultur (pH ~ 6,8), eine Zunahme von % CO₂ und eine gleichzeitige Abnahme von% O₂ w?hrend der Inkubation. Die Grafiken zeigen den erwarteten charakteristischen Verlauf des Wachstums von E. coli. In der ersten Lagphase (~ 1,5 h) gab es keine signifikanten ?nderungen des pH- und -CO₂ Wertes. W?hrend dieser Phase wurde Sauerstoff verbraucht. Nach ~ 1,5 h stieg der CO₂-Gehalt exponentiell an und O₂ nahm ab. In dieser Phase wurde das TBS-Medium verbraucht und die Zellen traten in die logarithmische Wachstumsphase ein. Der Sauerstoff nahm mit zunehmender Zellzahl ab und fiel w?hrend des Experiments auf Null. Dies zeigt sich auch in einem Anstieg des CO₂. Aufgrund des begrenzten Sauerstoffgehalts konnten E. coli nicht mehr im Mikrofluidik-Chip wachsen und der Prozess ging in die station?re Phase über. Nach 3 h fiel der O₂-Gehalt auf 3 %, w?hrend der CO₂-Gehalt auf 4 % anstieg. Die Sensoren zur ?berwachung der mikrobiellen Kultur zeigten umfassende Ergebnisse und erm?glichten eine genaue Beurteilung des aktuellen Kulturstatus.

Basierend auf den vorgestellten Ergebnissen k?nnen wir den Schluss ziehen, dass die PreSens SensorPlugs eine bequeme M?glichkeit sind, grundlegende Parameter (O₂, pH, CO₂) in der mikrofluidischen Bakterienkultur zu überwachen. PreSens SensorPlugs sind wichtig für die Analyse des Scale-Down-Ansatzes und die Prozessüberwachung bei der Optimierung kultivierter Bioprozesse. Zukünftige Experimente werden auf die kontinuierliche ?berwachung und Optimierung des Kultivierungsprozesses gerichtet sein und die Auswirkungen von ?therischen ?len und Antibiotika auf verschiedene antibakterielle und antimykotische Aktivit?ten in Mikrobioreaktoren untersuchen. Die Forschung konzentriert sich auf die Ermittlung der Korrelation zwischen den Messwerten von pH-, O₂- und CO₂-Sensoren mit zus?tzlichen Sensoren (impedimetrisch, optisch und elektrochemisch), die in mikrofluidische Bioreaktoren integriert sind, die wir am Institut zur Messung der Leitf?higkeit des Mediums, von Metaboliten oder der Biomasse entwickelt haben.