Entwicklung einer biomimetischen Lung-on-a-Chip Plattform

Die aktuelle COVID-19-Pandemie unterstreicht die Notwendigkeit einer universell verfügbaren, einfachen, erschwinglichen, skalierbaren und physiologisch relevanten Plattform, um die Auswirkungen einer Virusinfektion auf die menschliche Lunge zu untersuchen. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass eine aberrante und maladaptive Immunantwort und nicht die Virusreplikation zu einer akuten Lungenverletzung bei Patienten mit schwerem Krankheitsverlauf beitr?gt. Angesichts der Heterogenit?t der klinischen Ergebnisse ist es m?glich, dass einige Patienten eine schützende Immunantwort entwickeln, andere dagegen eine sch?dliche. Daher muss jede m?gliche Therapie zur Abschw?chung der durch das Immunsystem verursachten Verletzungen individualisiert werden. Um die Immunantwort auf SARS-CoV-2 zu verstehen und zu modulieren, ist eine schnelle Screening-Testplattform erforderlich, mit der die Wechselwirkung zwischen dem Virus und der Immunantwort sowie deren Auswirkungen auf die Lungenarchitektur und -funktion zuverl?ssig modelliert werden kann.
Bisher gibt es keine Modelle, die die Funktionseinheit des distalen Lungengewebes genau nachstellen k?nnen. Bereits existierende Lung-on-a-Chip-Modelle enthalten mikrofluidische Kanalnetzwerke, die in ein nicht biologisches Material wie Polydimethylsiloxan (PDMS) eingebettet sind, und k?nnen Wechselwirkungen zwischen Zelle und extrazellul?rer Matrix, physiologische Flussprofile, interstitielle Flüssigkeitsverschiebungen und Sauerstoffübertragung m?glicherweise nicht genau so nachstellen, wie sie in nativem Gewebe vorkommen. Darüber hinaus neigen nicht-biologische Materialien zu Thrombosenbildung und F?ulnis und sind daher m?glicherweise nicht wirksam bei der Untersuchung von Krankheitserregern mit langen Inkubationszeiten die mehrere Tage oder Wochen Kultivierung erfordern.
Bei IVIVA haben wir verschiedene Technologien eingesetzt, darunter 3D-Druck und Herstellung dünner Filmmembranen, um ein vollst?ndig biologisches Gerüst mit eingebetteten Gef??- und Atemwegsnetzwerken zu entwickeln, die durch eine dünne (ca. 5 ?m) por?se Gelatinemembran getrennt sind. Zellen k?nnen auf gegenüberliegenden Seiten der Membran ausges?t und in einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfl?chenkultur gehalten werden. In vorangegangenen Experimenten haben wir die Transplantation verschiedener Zellen in unsere 3D-Gerüste best?tigt und die Kultur über 21 Tage aufrechterhalten. Wir nehmen an, dass ein physiologisch relevantes biologisches Gerüst die Untersuchung der direkten Auswirkungen von Virusinfektionen auf das Lungengewebe sowie die immunologischen Folgen und die Bewertung therapeutischer Interventionen erm?glicht. Eine der wichtigsten funktionellen Metriken zur Bewertung des funktionellen Lungengewebes ist der Sauerstofftransfer von den Atemwegen in die vaskul?re Blutversorgung.
Unser erstes Ziel war es, unser Lung-on-a-Chip-Modell zu entwickeln und funktionelle Basismetriken für den Sauerstofftransfer und die Flüssigkeitsfiltration in einem azellul?ren Modell festzulegen. Diese Messungen werden als n?chstes in unseren Scaffolds wiederholt, die mit Endothelzellen und Alveolarepithelzellen im Gef??- bzw. Atemwegskompartiment besiedelt wurden. Indem wir zuerst die funktionellen Basismessungen für den Sauerstofftransfer in einem azellul?ren Gerüst festlegen, k?nnen wir dann die Auswirkungen von Zellen messen und mit bekannten physiologischen Werten vergleichen. Wir werden dann eine gut charakterisierende St?rung in das System einführen, das bakterielle Lipopolysaccharid (LPS), und seine Auswirkungen auf den Gastransfer messen, um unser Modell zu validieren.

Zuerst haben wir Basalmembranen definierter Zusammensetzung mit einer kontrollierten Dicke von ca. 5 ?m (ABB. 1a, b) hergestellt. Unter Verwendung von F127 als Opferporogen erzeugten wir Poren von 0,1 bis 4 ?m, ?hnlich denen, in der menschlichen Bronchialbasalmembran (Fig. 1c, d).

Dann wurden die Kan?le mit Opfergel-Tinte (Pluronic F127) auf beide Seiten der Membran in 3D gedruckt. Gelatine wurde unter Verwendung von 3D-gedruckten Kunststoffformen auf diese Membranen gegossen und unter Verwendung von mikrobieller Transglutaminase vernetzt, bevor die Opferkanalmuster ausgewaschen wurden. Nach der Evakuierung des F127 verbleiben Hohlkanalnetze, die direkt mit dem Durchfluss verbunden werden k?nnen, von einer Schlauchpumpe angetrieben und mit Flüssigkeit oder Luft durchstr?mt. Die hohlen Kan?le k?nnen auch mit Zellen bes?t werden, die an den Gelatinekanalw?nden haften und eine Zellmonoschicht bilden (Abb. 2a). Unsere Kanalgeometrie wurde mit einem 1000 ?m breiten Alveolarraum neben kleineren 200 ?m Gef??kan?len entworfen (Abb. 2b). Die Alveolaroberfl?che betr?gt 232 mm² und die Gef??oberfl?che 184 mm², ein Verh?ltnis von 1,26 (Abb. 2c). Um eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfl?chenkultur (ALI) für dieses Projekt zu etablieren, haben wir Luft mit einer peristaltischen Pumpe durch das Atemwegskanalnetz perfundiert, wobei die Durchflussraten mithilfe einer in LabView entwickelten benutzerdefinierten Software gesteuert wurden. PreSens O₂ SensorPlugs (zusammen mit pH- und CO₂-SensorPlugs) wurden sowohl am Einlass als auch am Auslass des Gerüsts im Fluidweg positioniert, wobei kontinuierlich Flüssigkeit durch das Gef??netzwerk perfundierte. Es gab auch Inline-Drucksensoren für den Luftr?hreneinlass (T), den Lungenarterieneinlass (PA) und den Lungenvenenauslass (PV) (Abb. 3a). Wir perfundierten 100% O₂ durch das Atemwegsnetz und ma?en die O₂-?bertragungsrate von den Luftkan?len über die Membran in das Gef??netz, indem wir die O₂-Konzentration am Auslass von der Einlasskonzentration subtrahierten, sobald das System bei einer bestimmten Flüssigkeits- und Gasflussrate das Gleichgewicht erreicht hatte.

Die mechanische und biochemische Umgebung der Lunge hat gro?en Einfluss auf die Zellfunktion. Bestehende In-vitro-Modelle rekapitulieren jedoch h?ufig die Physiologie nicht genau und enthalten h?ufig synthetische Materialien. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir ein vollst?ndig biologisches Modell entwickelt, das auf einer neuartigen Methode zur Erzeugung von 3D-Kanalnetzwerken basiert, die von Basalmembranen ausgekleidet sind. Wir haben die erzeugten Gerüste, die mit Epithelzellen (A549) und Endothelzellen (HUVEC) besiedelt wurden, bis zu 16 Tage lang in Perfusionsbioreaktoren mit konstanter Medienperfusions erfolgreich kultiviert (Abb. 4).
Wir haben die O₂ Diffusion und den Flüssigkeitstransfer in unseren Gerüsten gemessen und die strukturelle Integrit?t des Gerüsts nach 72-stündiger Perfusion mit 100 % O₂ und PBS bei physiologischem Druck best?tigt. Abbildung 5a zeigt die Messung der Sauerstoffkonzentration in einem Gerüst über einen Zeitraum von 48 Stunden unter Verwendung von PreSens Sauerstoffsensoren sowohl am Einlass als auch am Auslass des Gef??kanalnetzwerks. Der gesamte Sauerstofftransfer durch unser Gerüst ist definiert als Flüssigkeitsdurchfluss x (Ausgangs-O₂-Gehalt - Eingangs-O₂-Gehalt). Die Medienflussrate in den Kan?len wurde variiert, was die O₂ Konzentration im Laufe der Zeit beeinflusste. Nach 24 h O₂ Perfusion wurde die O₂-Einstr?mung über Nacht auf 4 mmHg Druck verringert und am n?chsten Tag nach 40 h wieder gestartet. Nach 48 Stunden wurde der O₂-Fluss gestoppt.
Nach Normalisierung der O₂-Diffusionswerte auf die Oberfl?che des Gef??netzwerks stellten wir fest, dass unsere O₂-?bertragungsrate mit einem kommerziellen Oxygenator, dem Sarns Turbo 440, vergleichbar war (Abb. 5b).

Bisher haben wir ein vollst?ndig nicht-synthetisches Lung-on-a-Chip-Modell entwickelt, das für Zellkultur an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle verwendet werden kann. Wir haben PreSens O₂ SensorPlugs verwendet, um den Sauerstofftransfer von einem gasdurchstr?mten Atemwegskanalnetz in ein flüssigkeitsdurchstr?mtes Gef??netz über eine dünne biologische Membran zu messen, und festgestellt, dass unser Gerüst ?hnliche Sauerstoffübertragungsf?higkeiten wie ein kommerzieller Oxygenator aufweist, wenn auf die Oberfl?che normalisiert wird. In zukünftigen Studein wird die Wirkung sowohl von Gef??endothel- als auch von Alveolarepithelzellen, die die Gef??- bzw. Atemwegsnetzkan?le auskleiden, auf den Sauerstofftransfer gemessen. Wir werden dann unser System mittels der gut etablierten St?rung mit bakteriellem LPS validieren, von der bekannt ist, dass sie sich nachteilig auf das ?berleben der Zellen und funktionelle Ergebnisse wie Gasaustausch und Flüssigkeitstransfer auswirkt. Nach der Validierung unserer Plattform gehen wir eine Zusammenarbeit mit dem Massachusetts General Hospital (MGH) und einem Labor an der Universit?t von Kalifornien in San Francisco (UCSF) ein, um die Auswirkungen des SARS-CoV-2-Virus auf das distale Lungengewebe zu untersuchen. Wir werden dies erreichen, indem wir ein pseudotypisiertes Virus, ein virus?hnliches Partikel, das mit dem "Spike"-Protein aus dem Coronavirus beschichtet ist, in unser Lungenmodell einführen und dessen Auswirkungen auf funktionelle Ergebnisse wie den Sauerstofftransfer messen. Diese In-vitro-Testplattform erm?glicht eine direkte Beobachtung der Auswirkungen des Virus auf das Lungengewebe sowie die Prüfung potenzieller therapeutischer Interventionen auf menschliche Zellen vor klinischen Studien.

Danksagung:
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von United Therapeutics und der Mendez National Institute of Transplantation Foundation unterstützt.