Nicht-invasive Online-Sauerstoffmessung

Bakterielle Toxizit?tstests in der pharmakologischen Wirkstoffforschung

Die Messung der Sauerstoffkinetik in Respirations-Inhibitionstests ist von zentraler Bedeutung für die pharmakologische Wirkstoffforschung und die toxikologische Prüfung von Chemikalien (REACH). Der neue SDR SensorDish? Reader erm?glicht erstmalig die nicht-invasive, simultane Online-Aufzeichnung in 24 Well Platten. Die Studie beschreibt die Verwendung des Systems in einem bakteriell-respiratorischen Toxizit?tstest.

Der Pseudomonas putida (P. putida) -Test zur Hemmung des Sauerstoffverbrauchs (1) wird verwendet, um die Wirkung einer Testsubstanz auf die Zellatmung in Bakterien unter Verwendung von Sauerstoffelektroden zu untersuchen. Herk?mmliche Sauerstoffelektroden sind jedoch für Hochdurchsatzanalysen ungeeignet, da eine effektive Miniaturisierung der Elektroden - die Voraussetzung für den gleichzeitigen Einsatz in kleinvolumigen Proben - nur begrenzt m?glich ist und invasive Messungen zu Kontaminationen führen k?nnten. Dieser Test wurde für das 24 Well Format des SensorDish? Readers angepasst. Der SensorDish? Reader liest den Sauerstoffgehalt berührungslos mittels optischer Sensoren am Boden jedes Wells der 24-Well Platte (OxoDish?) aus. Mit der entsprechenden Software k?nnen bis zu 10 Instrumente mit insgesamt 240 Proben gleichzeitig überwacht werden.

Probenvorbereitung

P. putida Migula (DSM 50026) wurde 24 h auf Standard-Agar S1 gezüchtet, und eine ?bernachtkultur (16 h) davon wurde in einem S1-Medium herangezogen. Die Bakterien wurden mit einem Phosphatpuffer (pH: 7,2, 50 mM) gewaschen und auf eine optische Dichte (OD₄₃₆) von 0,4 Verdünnung eingestellt. Kupfersulfatl?sung mit acht Konzentrationen im Bereich von 1 · 10^-4 bis 2 · 10^-7 wurde als Testsubstanz verwendet. In Abweichung vom Standardverfahren wurde eine h?here Bakterienkonzentration verwendet und 100 mM NaCl zur Testl?sung gegeben. Eine Mischung von 0,4 ml der Bakterienl?sung, 0,4 ml einer 2,5 M Glucosel?sung und 19,2 ml der Kupfersulfatl?sung wurde 30 Minuten bei 23 ?C in einem Schüttelkolben unter Rühren vorinkubiert. Aus dieser Mischung wurden 3 ml / Vertiefung auf das OxoDish? übertragen und der Sauerstoffgehalt der Proben wurde 15 Minuten lang ohne Rühren mit dem SensorDish? Reader aufgezeichnet.

Die Kinetik (Abb. 2) zeigte, dass niedrige Kupfersulfatkonzentrationen (bis zu 10^-6 M) keine hemmende Wirkung auf den oxidativen Metabolismus hatten. Der Sauerstoffverbrauch der Kultur nahm mit zunehmender Kupfersulfatkonzentration ab; bei Kupfersulfatkonzentrationen von 4,5 · 10^-5 und darüber wurde die Bakterienatmung vollst?ndig inhibiert. Der Vergleich der Kinetiken für die ungehemmte bakterielle Atmung und der mit den Testsubstanzen in verschiedenen Konzentrationen behandelten Bakterien erlaubte es, den Inhibitionsgrad anhand der Steigung zu berechnen. Die Hemmung ergibt sich aus dem Quotienten bekannter Messwerte: 100 x (Steigung ohne Hemmung - Steigung mit Hemmung) / Steigung ohne Hemmung. Aus der resultierenden Dosis-Antwort-Kurve (Abb. 3) wurde ein EC50-Wert von 5,0 · 10^-6 (1,25 mg/l) Kupfersulfat ermittelt. Die EC50 (halbmaximal effektive Konzentration) ist definiert als die Testsubstanzkonzentration, die im Testorganismus zu einer Hemmung des Sauerstoffverbrauchs von 50 % führt.

Simultanes Screening mehrerer Proben

Die Ergebnisse stimmen sehr gut mit den bekannten Informationen über die Toxizit?t von Kupfersulfat überein und best?tigen die Ergebnisse einer früheren Studie (2). Sie zeigen das gro?e Potenzial der neuen Messtechnik für pharmakologisch-toxikologische Screeningtests. Der SensorDish? Reader erm?glicht die schnelle, gleichzeitige Messung einer gro?en Anzahl von Proben. Da die Probe w?hrend der Messung nicht bewegt wird, ist der passive Sauerstoffeintrag über die kurze Messdauer von 15 Minuten vernachl?ssigbar, so dass die Probe nicht abgedeckt werden muss. Die Anforderungen an Kulturmedium, Bakterienmenge und Testsubstanz sind im Vergleich zu denen der herk?mmlichen Methode (Testvolumen von 100 ml auf 3 ml verringert) sehr niedrig, ebenso wie die für die Tests ben?tigte Zeit, da das System einfach anzuwenden ist und keine zus?tzliche Kalibrierung erfordert. Kostenintensive und empfindliche Sauerstoffelektroden k?nnen eingespart werden. Der SDR SensorDish? Reader bietet eine kostengünstige und schnelle Testmethode für die Wirkstoffforschung und Toxikologie.

Referenzen
1. Pseudomonas putida Atmungshemmtest (Pseudomonas putida Respiration Inhibition Test), DIN 38412, Part L27:1992.
2. Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlamm-Untersuchung (German Standard Procedure for Water, Wastewater, and Sediment Testing), Part VI, Wiley-VCH, Weinheim (2001)