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Auswirkung einer Pseudomonas-Infektion auf den Stauerstoffstatus von Arabidopsis-Bl?ttern
Visualisierung der Sauerstoffdynamik in Pflanzengewebe
Jagadis Gupta Kapuganti
Biochemistry & Systems Biology, Department of Plant Sciences, University of Oxford, GB
Um die Verbreitung von Krankheitserregern zu verhindern, verwenden infizierte Pflanzen eine Art von Zelltod - die sogenannte hypersensitive Reaktion. In dieser Studie wurde das weit verbreitete Modellsystem von Arabidopsis und Pseudomonas zur Untersuchung von Pflanzen-Pathogen-Interaktionen und Krankheitsentwicklung verwendet. Das VisiSens? Sauerstoff-Bildgebungssystem wurde zur genaueren Untersuchung der Sauerstoffverteilung in infizierten Bl?ttern, die eine hypersensitive Reaktion durchliefen, angewendet. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Sauerstoffkonzentrationen nicht ?nderten, wenn Pflanzen mit Kontrollmedium behandelt wurden, w?hrend die Sauerstoffkonzentrationen in Bl?ttern, die mit Pseudomonas syringae infiziert waren, nach sechs Stunden abzunehmen begannen. Innerhalb von 24 Stunden erreichten diese Bl?tter einen Sauerstoffgehalt von 50 %.
Die hypersensitive Reaktion (HR) ist eine Form des Zelltods. Es ist ein Mechanismus, den Pflanzen nutzen, um die Ausbreitung von Krankheitserregern zu verhindern. Eine der Eigenschaften von HR ist der schnelle Zelltod, der in der infizierten Region des Wirts stattfindet, um eine weitere Ausbreitung des Pathogens zu verhindern. Pathogene sezernieren avirulente Genprodukte, die von avr-Genen kodiert werden. Diese avr-Genprodukte interagieren mit Pflanzenresistenz-Genprodukten (R-Genen) und diese Interaktion führt zur Entwicklung von HR. Zellen, die HR durchlaufen, produzieren verschiedene freie Radikale wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Superoxid (O2-), Stickoxid (NO), Peroxynitrit (ONOO-) und viele Zwischenprodukte freier Radikale. Diese Verbindungen sind an der Signalgebung w?hrend der HR beteiligt. Sauerstoff ist lebenswichtig für die Pflanzenatmung, er fungiert als terminaler Elektronenakzeptor in der mitochondrialen Elektronentransportkette der Pflanze. Sauerstoffproduktion und -konsum finden in den grünen Bl?ttern statt. Sauerstoffgehalt und Atmung spielen eine Rolle bei der Produktion verschiedener freier Radikale und bei der metabolischen Reprogrammierung von Pflanzen. Arabidopsis und Pseudomonas ist ein weit verbreitetes Modellsystem zur Untersuchung der Pflanzen-Pathogen-Interaktion und der Krankheitsentwicklung. Bisher wurde in diesem Modell viel Forschung betrieben, um Pflanzen-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, aber es ist fast nichts ist über die Sauerstoffverteilung in infizierten Bl?ttern bekannt, die HR durchlaufen. Diese Information ist sehr wichtig für das Verst?ndnis von Pflanzenkrankheiten und Resistenzmechanismen. Der virulente Stamm P. syringae pv. Tomate DC3000 avr (Pst) produziert Toxine, die Chlorose und L?sionen im infizierten Wirtsgewebe induzieren. In dieser Studie haben wir das Sauerstoff-Bildgebungssystem VisiSens? verwendet, um die Sauerstoffverteilung in infizierten Bl?ttern über l?ngere Zeitr?ume zu überwachen. Die optische Sensorfolie wurde an der Blattoberfl?che befestigt und mit der Detektoreinheit ausgelesen. Die aufgenommenen Bilder wurden verwendet, um Sauerstoffver?nderungen in den infizierten Bl?ttern zu quantifizieren.
Material & Methoden
Eine sauerstoffempfindliche Sensorfolie (SF-RPSU4, PreSens) wurde auf die untersuchten Bl?tter gelegt und mit der USB-betriebenen Detektoreinheit (VisiSens?, PreSens) ausgelesen. Die Zweipunktkalibrierung der Sensorfolie wurde durchgeführt, indem ein Tropfen frisch hergestellten Natriumdithionats (Na2S2O4) in die Mitte der Sensorfolie gegeben und ein Bild aufgenommen wurde, das zur sp?tere Berechnung der Sauerstoffkonzentrationen mit der VisiSens AnalytiCal 1 Software diente. Nach dem Aufzeichnen des Kalibrierwertes wurde die Sensorfolie zuerst durch Abwischen mit 70 % Ethanol sterilisiert und mehrmals mit autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser abgewischt. Sobald die Sensorfolie getrocknet war, wurde sie auf das Blatt gelegt. Ein Tropfen Wasser wurde auf das Blatt gegeben, um den direkten Kontakt der Probenoberfl?che mit der Sensorfolie zu erm?glichen. Pseudomonas syringae pv. DC3000-Bakterien wurden über Nacht in KB-Medium gezüchtet, dann bei 3.000 g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und dreimal mit 10 mM MgCl2 gewaschen. Sie wurden in MgCl2 resuspendiert und die optische Dichte bei 600 nm gemessen. Die Bakterien wurden in 10 mM MgCl2 auf 0,005 verdünnt und dann in die Abaxialseite des Blattes infiltriert. Nach der Infiltration wurde die Sensorfolie auf das Blatt gelegt und der Sauerstoffgehalt aufgezeichnet. Sauerstoff wurde nach 0, 2, 4, 6, 16 und 24 Stunden gemessen.
Sauerstoffniveaus in infizierten Bl?ttern
Es ist sehr wichtig, die Sauerstoffdynamik in Pflanzengeweben, die einem pathogenen Angriff ausgesetzt sind, zu kennen. Der Sensor gab Informationen über die Sauerstoffverteilung und -dynamik w?hrend des Infektionsprozesses. Es war m?glich, quantifizierte Sauerstoffwerte zu erhalten, die für die Interpretation der Daten wichtig sind. Bl?tter, die mit avirulenten Krankheitserregern infizierte sind, durchlaufen verschiedenen Ver?nderungen. Die Erkennung eines Erregers oder pathogener Ausl?ser führen zu oxidativen Schüben und zur Bildung verschiedener freier Radikale. Um ROS in pathogeninfizierten Pflanzen vollst?ndig zu verstehen, sind Sauerstoffver?nderungen ein Schlüsselfaktor. Zum Beispiel induziert Hypoxie die Stickoxidproduktion. Das produzierte NO reagiert wiederum mit Superoxid und bildet Peroxinitrit (ONOO-), welches eine sehr wichtige Verbindung ist, die den Zelltod induziert. In diesen Experimenten fanden wir heraus, dass sich die Sauerstoffniveaus nicht ver?nderten, wenn Bl?tter mit 10 mM MgCl2 als Kontrolle behandelt wurden (3). In mit Pseudomonas infizierten Bl?ttern begann der Sauerstoffgehalt ab der sechsten Stunde abzunehmen (Abb. 2). Nach 16 Stunden fiel die Sauerstoffkonzentration auf 70 % und erreichte nach 24 Stunden 50 % (Abb. 4). Die Abnahme des Sauerstoffgehalts zu sp?teren Zeitpunkten w?hrend der Infektion kann mehrere Gründe haben: Eine m?gliche Erkl?rung besteht darin, dass die hypersensitive Reaktion viele Prozesse mit dem Alterungsprozess teilt. Mitochondrien k?nnen sich in sp?teren Stadien dieser Entwicklung aufl?sen. Ein anderer m?glicher Grund ist, dass Bakterien Sauerstoff verbrauchen und sich schnell entwickeln, w?hrend sie mit den Bl?ttern um Sauerstoff konkurrieren. Drittens ist die Photosynthese des grünen Blattes betroffen, was zu einer geringeren Sauerstoffproduktion führt.
Zusammenfassung
Mit dem VisiSens? Sauerstoffbildgebungssystem konnten Sauerstoffverteilungen und -dynamiken an infizierten Pflanzenbl?ttern bestimmt werden. Die Experimente lieferten erste Einblicke in zeitliche Ver?nderungen der Sauerstoffverteilung w?hrend der Krankheitsentwicklung. Weitere Experimente unter Verwendung verschiedener virulenter und avirulenter Pathogene und die Messung von Sauerstoff in verschiedenen transgenen Pflanzen, die mit verschiedenen Pathogenen infiziert sind, werden sehr wertvolle Informationen über biochemische Ereignisse w?hrend Pflanzen-Pathogen-Interaktionen liefern.