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Design of Experiment (DoE) für Fed-Batch Prozessentwicklung in geschüttelten Kulturen
Bestimmung der Reporduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Escherichia coli Kulturen unter Fed-Batch Bedingungen mittels SensorDish? Reader und Sensor Flasks
F. Glauche, N. Cruz, A. Knepper, M. F?llmer, S. Junne, P. Neubauer
Labor für Bioverfahrenstechnik, Institut für Biotechnologie, TU Berlin, Deutschland
Bei der Entwicklung eines rekombinanten Proteinproduktionsprozesses muss eine gro?e Anzahl paralleler Kultivierungen durchgeführt werden. Dies wird meistens unter Verwendung von Batch-Kulturen in Schüttelkolben oder Mikrotiterplatten gemacht, wo die Fermentationsbedingungen nicht überwacht werden. Um diese Einschr?nkung zu überwinden, wurden der SensorDish? Reader und der Shake Flask Reader mit dem enzymatischen Glucose-Zufuhrsystem (EnBase?) für Escherichia coli Kultivierungen kombiniert. Es zeigte sich, dass SensorDish?-Kulturen reproduzierbare Prozessdaten lieferten und die Ergebnisse direkt mit dem Schüttelkolben-Ma?stab vergleichbar waren
Eine konsequente Prozessentwicklung vom Mikroliter- bis zum industriellen Ma?stab, insbesondere in der Biotech-Industrie, erfordert die Berücksichtigung vieler verschiedener Aspekte, um den ?bergangsprozess komplett zu verstehen. In dieser Studie wurde ein DoE erstellt, um optimale Parameter für zwei verschiedenen Kultivierungs-Ma?st?be zu bestimmen. Derartige Batch-Kultivierungen in orbital geschüttelten Systemen (meist Schüttelkolben, aber auch Mikrowellplatten und Fermenter im Laborma?stab) werden verwendet, um mit m?glichst geringem Aufwand akzeptable Ergebnisse zu erzielen. Leider wird dabei der entscheidende Einflusses der Bedingungen bei der Gro?produktion, auf die Qualit?t des Produkts und die Ausbeute des Verfahrens, nicht berücksichtigt. Die wichtigsten Parameter, die im Screening- und Laborma?stab vernachl?ssigt werden, sind: 1) der Fed-Batch Betrieb, bei dem die Dosierung der Kohlenstoffquelle und der pH-Wert kontrolliert werden, und 2) die Konzentrationsgradienten, verursacht durch gro?e Volumina, unzureichende Rühr- / Misch-Kapazit?t und Betriebskostenreduzierung. Batch-Prozesse im Laborma?stab haben hohe Anfangskonzentrationen der Kohlenstoffquelle und der pH-Wert kann sich im Laufe der Zeit ?ndern. Darüber hinaus zeigen Schüttelkolbenkulturen unbedeutende Konzentrationsgradienten im Medium, die das Studium des Bakterienwachstums unter sich schnell ?ndernden Bedingungen behindern (z. B. Glukosepulse). Bei Mikrotiterplatten werden nur wenige Informationen erzeugt und die oben genannten Einschr?nkungen bestehen ebenfalls. Darüber hinaus ist die Probennahme sowie die Hochpr?zisionsanalyse aufgrund der geringen Volumina begrenzt. Es ist daher wichtig, das tats?chliche Limit jedes Ma?stabs (Mikrowell, Kolben, Minireaktor, Gro?reaktor) sowie seine Beziehung zu allen anderen Schritten in der Produktentwicklungskette zu verstehen. Darüber hinaus ist es wichtig, zuverl?ssige mathematische, analytische, ?berwachungs- und Kontrollmethoden zu schaffen, um die Informationen zwischen den verschiedenen Phasen zu übertragen. In dieser Arbeit wird ein Vergleich von Fed-Batch Kultivierungen in zwei verschiedenen Ma?st?ben, n?mlich 24-Well-Platten (3,3 ml) und Schüttelkolben (125 ml), verglichen. Dazu wird die PreSens Fluoreszenzsensorik eingesetzt, um sowohl gel?sten Sauerstoff als auch pH-Wert in der Kultur online zu überwachen (Abb. 1). Auf diese Weise soll eine mathematische Beziehung zwischen Mikro- und Milliliter-Ma?stab entwickelt werden. Dieser Ansatz sollte ein besseres Design von Schüttelkolbenexperimenten erm?glichen, basierend auf Informationen, die zuvor im Well-Platten-Ma?stab erhalten wurden.
Material & Methoden
Um Substrat-limitierte Fed-Batch Kultivierungen in Platten und Kolben durchzuführen, wurde das enzymatische Glukose-Zufuhrsystem EnBase? (BioSilta) verwendet. EnBase? emuliert die Glukosezufuhr, indem es Glukose aus einem Polysaccharid mittels einer enzymatischen Reaktion freisetzt. Die Zufuhr von Glukose in der Kultur kann mit der Menge des Enzyms EnZ, das zugegeben wird, kontrolliert werden. Ziel der Versuche war die Bestimmung des optimalen Volumens und der Enzymkonzentration für Platten und Kolben. Ein D-optimaler Versuchsplan wurde mit MODDE (Umetrics) erstellt, mit den Faktoren Enzym (EnZ I'm) -Konzentration (0 bis 30 U/l) und Volumen (0,5 bis 2,1 ml in 24-Well-Platten, 7 bis 15 ml in Kolben). Die optische Dichte wurde als Antwort gew?hlt. 11 Tests wurden mit unterschiedlichen Volumina und Enzymkonzentrationen für die zwei verschiedenen Ma?st?be durchgeführt: 24-Well OxoDishes? und HydroDishes? mit dem SDR SensorDish? Reader-Messsystem und Schüttelkolben, die mit pH- und DO-Fluoreszenzsensoren ausgestattet waren und mit dem SFR Shake Flask Reader ausgelesen wurden. Die SensorDishes? wurden mit "System Duetz" Sandwich-Abdeckungen und Klemmsystemen (EnzyScreen) kombiniert. Zus?tzlich zu den Online-Messungen von pH und DO wurde das Bakterienwachstum in einem Spektrophotometer bei 600 nm (OD600) gemessen. Die enzymatische Zufuhr wurde mit EnPresso?-Medium (BioSilta) durchgeführt, das gem?? der Beschreibung des Herstellers hergestellt und mit E. coli BL21-Zellen inokuliert wurde; die anf?ngliche OD600 der Kulturen lag zwischen 0,1 und 0,3. W?hrend der gesamten Kultivierung wurden pH und DO kontinuierlich in den Mikrowellplatten und in den Schüttelkolben überwacht, um konstante Bedingungen ohne Sauerstofflimitierung und einen pH-Wert zwischen 5 und 7,5 zu gew?hrleisten. Die ?bernachtkulturen wurden in zweistündigen Intervallen von den jeweiligen Lesern genommen, um die optische Dichte OD600 zu bestimmen.
Vergleich von SDR und SFR
Wie in Abbildung 2 dargestellt ist, zeigen alle Kurven für gel?sten Sauerstoff die charakteristischen Trends einer substratlimitierten Fed-Batch Kultur. Die Konzentration des Enzyms ist w?hrend jedes Experiments konstant; dies induziert eine quasi konstante Zufuhr von Glukose w?hrend der Kultivierung. In der ersten Phase führt die niedrige Zelldichte zu einer verringerten Gesamtglukoseaufnahmekapazit?t, was eine Glukoseakkumulation erm?glichte, die eine Anfangsphase des exponentiellen Wachstums induzierte. Der schnelle Anstieg der Atmungskapazit?t der Bakterien wurde durch den beschleunigten Abfall der DOT-Kurve angezeigt. Die Abnahme der pH-Werte zeigte die Sekretion von sauren Verbindungen, haupts?chlich Essigs?ure. Die zweite Phase war durch Substratbeschr?nkung gekennzeichnet. ?berschüssige Glukose wurde verbraucht und Zellen waren gezwungen, ihre Wachstumsrate und die Atmung zu verringern, um sich an die neuen Bedingungen anzupassen. Wie in Abbildung 2 dargestellt ist, h?ngt die anf?ngliche Abnahme von DOT, die mit dem SDR sowie dem SFR aufgezeichnet wurde, von der Menge an Glukose freisetzendem Enzym ab, die der Kultur zugesetzt wurde. So konnte eine optimale Menge an Enzym für schnelles aerobes Wachstum bestimmt werden (Abb. 2 A - C). Wie erwartet, erlaubten Kulturen im Schüttelkolben einen besseren Sauerstofftransfer, so dass die Enzymkonzentrationen auf bis zu 23,3 U l-1 erh?ht werden konnten, ohne Sauerstofflimitierung zu erreichen. Die Trends der SDR-Experimente konnten im Schüttelkolbensystem reproduziert werden; ein ?hnliches DOT- und pH-Profil wurde aufgezeichnet (Abb. 2 D - F). Au?erdem wurde die Reproduzierbarkeit der Kulturen demonstriert. Variationen zwischen verschiedenen Wells und verschiedenen Kulturen waren statistisch nicht signifikant (Daten nicht gezeigt).
Zusammenfassung
DOT und pH sind essentielle Messgr??en für die ?berwachung des Kulturzustands in der Bioproduktion. Die M?glichkeit, sowohl DOT als auch pH bereits in frühen Entwicklungsstadien wie Screening-Experimenten in Mikrotiterplatten und Schüttelkolben zu überwachen, ist ein gro?er Schritt in Richtung schnellerer Bioprozessentwicklung. Die Kombination dieser neuen Messger?te mit den entsprechenden Modellen zur ?berwachung und Vergr??erung erm?glicht einen effizienteren Informationsfluss zwischen kleinem und mittlerem Ma?stab. Die Screening-Effizienz wird erh?ht, indem das Zellwachstum unter aeroben, Substrat-limitierten und pH-stabilisierenden Bedingungen m?glich wird. Kontrollierte Fed-Batch Kultivierungen erlauben nicht nur eine h?here Produktbildung, sondern auch eine h?here ?hnlichkeit zu Produktionsbedingungen in gro?em Ma?stab.