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Echtzeit-Respirationsmessungen
Messungen der aeroben Atmung komplexer mikrobieller Gemeinschaften
B. R. Roller1, Z. M. Lee1, K. E. Studer-Rabeler2, und T. M. Schmidt1
1Dept. of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, East Lansing, MI, USA
2Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI, USA
Viele Methoden zur Messung der aeroben Atmung, einschlie?lich Elektroden und kolorimetrischer Tests, bieten nur eingeschr?nkte M?glichkeiten etwa Replikationsmessungen durchzuführen oder den Sauerstoffverbrauch in Echtzeit zu erfassen. Das OxoDish? - eine Mikrotiterplatte mit integrierten Sauerstoffsensoren - und der SDR SensorDish? Reader bieten die M?glichkeit, gleichzeitig vierundzwanzig Respirationsmessungen in Echtzeit durchzuführen. ?kologen, die die Atmung komplexer mikrobieller Gemeinschaften untersuchen, k?nnen davon profitieren.
Unser Ziel war die Optimierung des SDR OxoDish?-Systems zur Messung des Sauerstoffverbrauchs in Bakterien-Reinkulturen und in Bodenschl?mmen mit komplexen mikrobiellen Gemeinschaften. Bodenschl?mme sind besonders herausfordernd, da sich Bodenpartikel auf der Optode absetzen k?nnen. Zwei Modifikationen des OxoDish? waren n?tig, um den O2-Verbrauch für diese Proben genau zu messen: den O2-Eintrags in die Wells der Mikrotiterplatte zu minimieren und die L?sung gut zu mischen, so dass der O2-Verbrauch in der gesamten Tiefe des Wells homogen war. Eine Reinkultur des Pseudomonas Stammes HF3 und Waldboden wurde verwendet, um die Modifikationen am OxoDish? zu testen.
Material & Methoden
Der O2-Eintrag in mit Klebefolie bedeckte Wells wurde experimentell bestimmt. Ein Wachstumsmedium, das Resazurin, einen kolorimetrischen Indikator für O2, und Cystein, ein Reduktionsmittel das O2 verbraucht, enthielt wurde unter anaeroben Bedingungen in einer Vinylkammer / Glovebox in 12 Vertiefungen eines OxoDish? gegeben. Die Wells wurden so voll wie m?glich gemacht, und die H?lfte der Vertiefungen mit Klebefolie bedeckt. Das OxoDish? wurde bei Umgebungssauerstoffatmosph?re bei 25 °C und 100 U/min auf einem Rotationsschüttler inkubiert, und die abgedeckten mit den unbedeckten Wells verglichen. Mit einem sterilen Wachstumsmedium als Negativkontrolle wurde die Wirkung von Glaskügelchen auf den O2-Verbrauch getestet. Diese wurden verwendet, um das Mischen durch Rotationsschütteln weiter zu f?rdern. Proben des Pseudomonas Stammes HF3 wurden aus einer angeglichenen Wachstumskultur entfernt und in sechs OxoDish? Wells gegeben, von denen die H?lfte 2 sterilisierte Glaskügelchen pro Vertiefung enthielt und mit Klebefolie bedeckt war (Abb. 1). In 120-minütigen Experimenten bei 25 °C und 100 U/min, wurde die O2-Konzentration alle 15 Sekunden in jedem Well gemessen. Bei allen Ratenmessungen wurden die ersten 5 Minuten der gesammelten Daten verworfen, um die ?quilibrierungszeit zu berücksichtigen. Die Perlen- und Folienmodifikationen des OxoDish? wurden dann für Bodenschlammproben eingesetzt. Waldboden wurde gesiebt (2 mm) und 1 : 1 (w : v) in 10 mM MES-Puffer (pH 6), erg?nzt mit 50 ?g/ml Cycloheximid und 2,3 mM Natriumpyrophosphat, resuspendiert. Die Bodenaufschl?mmung wurde 30 Minuten lang gerührt, durch 8 Lagen Seihtuch filtriert und für unterschiedliche Partikelbeladung durch ein 100 ?m- oder 40 ?m-Zellsieb gesiebt. Die Aufschl?mmung wurde dann in Wells mit zwei sterilen Glaskügelchen gegeben, wie für reine Kulturversuche beschrieben, und steriler Puffer wurde als negative Kontrolle verwendet.
Sauerstoffeintrag
Wells, die steriles anaerobes Medium enthielten und mit Klebefolie bedeckt waren, wiesen für mehr als 120 Minuten keinen nachweisbaren O2-Eintrag auf, w?hrend unbedeckte Wells nach 40 Minuten in Umgebungsatmosph?re unter Schütteln mit 100 U/min O2-Eintrag zeigten (Abb. 2). Die 40-minütige Verz?gerung bei der SDR-Detektion des O2-Zuflusses in unbedeckten Wells kann darauf zurückgeführt werden, dass Cystein s?mtlichen Sauerstoff verbrauchte, der in das Medium diffundierte. Resazurin best?tigte die SDR-Werte, wobei sich die 6 unbedeckten Wells innerhalb von Minuten nach Entfernen aus der anaeroben Umgebung rosa verf?rbten, was auf einen O2-Eintrag hinwies. Fünf der sechs abgedeckten Vertiefungen blieben jedoch klar, was zeigte, dass über viele Stunden kein Sauerstoffeintrag stattfand.
Sauerstoffverbrauch reiner Kulturen
Im zweiten Experiment wurde die Atmung des Pseudomonas Stammes HF3 und die Wirkung des Mischens mit Glaskügelchen gemessen. Der bakterielle O2-Verbrauch in Wells, die mit Kügelchen gemischt wurden, war weniger variabel als in Wells ohne Kügelchen, was auf eine homogenere L?sung in der gesamten Tiefe des Wells zurückzuführen ist (Abb. 3). Mit linearer Regression wurde die mittlere O2-Verbrauchsrate für Proben mit Glaskügelchen auf 5,74 nmol/min berechnet, und die Replikate hatten einen Variationskoeffizienten (c. V.) von 6,7 %. Die mittlere Rate für Proben ohne Kügelchen betrug 11,86 nmol/min (c. V. = 18,9 %). Die O2-Verbrauchsraten wurden nicht um den O2-Eintrag korrigiert, aber sie sind für Vergleiche der Variabilit?t bei unterschiedlichen Behandlungen geeignet. Zellen, die sich auf der Optode absetzten, hatten keinen nachweisbaren Einfluss auf die Messungen, wenn die Kulturen mit Kügelchen gerührt wurden, da sich die Geschwindigkeit des O2-Verbrauchs nach einer Verdopplungszeit der reinen Kulturpopulation verdoppelte (Daten nicht gezeigt). Dies weist darauf hin, dass die L?sung homogen war und keine Ver?nderung des Wachstums auftrat, wenn die Bakterien von einem Kolben in ein verschlossenes OxoDish?-Well überführt wurden. Die spezifische O2-Verbrauchsrate mit Kügelchen (Mittelwert 2,0 × 10-7) ist zwar nicht auf O2-Eintrag korrigiert, ist jedoch ?hnlich der Rate, die mit Mikrorespirometrie gemessen wurde (Mittelwert 3,4 × 10-7).
Sauerstoffverbrauch von Bodenschlamm
Die Glaskugel- und Folienmodifikationen des OxoDish? wurden dann für eine komplexe mikrobielle Gemeinschaft verwendet. Die O2-Verbrauchsraten wurden für eine Bodenaufschl?mmung gemessen, die durch zwei unterschiedlich gro?e Zellsiebe für unterschiedliche Teilchenbeladungen filtriert wurde. Der gr??te Unterschied zwischen den beiden Ans?tzen mit unterschiedlicher Partikelbeladung bestand in der Variabilit?t der Messung, wobei die 40μm-gesiebten Proben einen Variationskoeffizienten für die mittlere O2-Verbrauchsrate von 7,08 % aufwiesen, was viel kleiner ist als der Variationskoeffizient der 100μm-gesiebten Proben mit 35,05 % (Abb. 4). Die Abnahme der Variabilit?t für 40μm-gesiebte Proben wird auf eine erh?hte Homogenisierung der Bodenaufschl?mmung im Well zurückgeführt, wogegen die 100μm-gesiebten Proben zu viele Partikel enthielten, die sich absetzen.
Zusammenfassung
Der SDR zusammen mit dem OxoDish? ist für Studien in der mikrobiellen ?kologie sehr nützlich, da sich leicht Replikations- und Echtzeitmessungen durchführen lassen. Das OxoDish? kann mit einer Klebefolie modifiziert werden, um den O2-Eintrag in die Wells der Mikrotiterplatte zu minimieren. Mit Glaskügelchen l?sst sich in der gesamten Tiefe eines Wells eine homogene L?sung erzeugen. In zukünftigen Untersuchungen komplexer mikrobieller Gemeinschaften k?nnen mit dem SDR und OxoDish? der O2-Verbrauch gemessen und gleichzeitig mehrere Variablen manipuliert werden, wobei eine gro?e Replikationskapazit?t erforderlich sein wird.