Eine neue Methode zur Vorhersage der Sauerstoffversorgung w?hrend aeroben Wachstums

Messungen mit dem SFR Shake Flask Reader erm?glichen die k_La-Bestimmung und zuverl?ssige Gestaltung der Kultivierungsbedingungen in Einweg-Schüttelkolben

Gel?ster Sauerstoff (DO) ist ein Schlüsselparameter w?hrend der aeroben Kultivierung, und aufgrund seiner geringen L?slichkeit kann Sauerstoff unter bestimmten Kulturbedingungen limitiert sein. In dieser Studie wurde eine neue Methode zur Vorhersage der Sauerstofftransferrate, Sauerstoffs?ttigung und maximalen Zellkonzentration unter verschiedenen Kulturbedingungen in Einweg-Schüttelkolben entwickelt. Dafür wurden neue mathematische Korrelationen zur Bestimmung des volumetrischen Gas-Flüssigkeits-Stoffübergangskoeffizienten (k_La) aus Füllvolumen, Gef??gr??e und Schüttelgeschwindigkeit ermittelt. Sauerstoffmessungen wurden mit dem SFR Shake Flask Reader durchgeführt. Nach Tests mit Corynebacterium glutamicum konnte gezeigt werden, dass mit dieser neuen Methode eine zuverl?ssige Gestaltung der Kulturbedingungen erreicht und eine Vorhersage über die maximal m?gliche Zellkonzentrationen ohne Limitierung getroffen werden konnten.

k_La wurde in Schüttelkolben mit und ohne Schikanen, unterschiedlicher Gr??e (125, 250, 500 ml) und mit integrierten Sauerstoff- und pH-Sensoren (SFS Sensor Flasks, PreSens) quantifiziert. Die Messungen wurden in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 30 und 37 °C in einem Orbitalschüttler mit einem Schütteldurchmesser von 50 mm durchgeführt. Für die DO-?berwachung verwendeten wir den SFR Shake Flask Reader (PreSens). Die Schüttelkolben wurden mit Puffer und Co(NO₃)₂ (0,1 mM) ?quilibriert. Die vollst?ndige Sauerstoffabreicherung wurde durch Zugabe von 200 g l^-1 Na₂SO₃-Stamml?sung erreicht. Die Arbeitsvolumina (10 - 40 % maximales Füllvolumen) und Schüttelfrequenzen (50, 150, 250 UpM) wurden variiert und alle Messungen wurden dreifach durchgeführt. k_La wurde unter Verwendung von Berkley MADONNA (Ver. 8.0.1) zwischen 20 und 90 % der Sauerstoffs?ttigung bestimmt. Für die k_La-Sch?tzung wurden empirische Korrelationen zwischen Kolbengr??e, Schüttelfrequenz und k_La basierend auf experimentellen Daten zusammengestellt. Die mathematische Anpassung verwendete entweder die Gau?-Funktion oder die Parabolfunktion [1]. C. glutamicum ATCC 13032 wurde mit Mineralsalzmedium kultiviert. Die Kulturen wurden in 250 ml Schüttelkolben mit Schikanen (SFS, PreSens) bei 30 °C und 150 U/min mit einem Füllvolumen von entweder 10 oder 30 % gezüchtet. Letzteres wurde verwendet, um die spezifische Wachstumsrate und die spezifische Sauerstoffaufnahmerate zu bestimmen. Diese experimentell bestimmten Werte für Wachstum und Sauerstoffaufnahme wurden verwendet, um den Anstieg der Biomassekonzentration und die Abnahme von DO w?hrend des Wachstums von C. glutamicum bei 30 °C, 150 U/min in 250 ml Schüttelkolben bei 10 % Füllvolumen vorherzusagen.

k_La Quantifizierung in Schüttelkolben

k_La wurde durch Online-Sauerstoffüberwachung in mit Puffer gefüllten Schüttelkolben mit und ohne Schikanen bestimmt. Sauerstoff wurde vollst?ndig durch Zugabe von Na₂SO₃ zu dem System entfernt. Als die durch Co₂⁺ katalysierte Redoxreaktion abgeschlossen war, erh?hte sich der gel?ste Sauerstoff in den Kolben, was zur Bestimmung von k_La für die gegebenen Bedingungen verwendet werden konnte. Für die untersuchten Schüttelkolben wurden bemerkenswert hohe k_La-Werte von bis zu 350 h^-1 ermittelt. Für Schüttelkolben ohne Schikanen war der k_La im Allgemeinen niedriger, mit max. k_La-Werten von 100 h^-1 [1]. Die Schüttelfrequenz hatte den signifikantesten Einfluss auf den Sauerstofftransfer. Die Gef??gr??e hatte kaum einen statistisch relevanten Einfluss auf den k_La von Kolben ohne Schikanen, zeigte jedoch eine gewisse Wirkung auf k_La in Schikanenkolben. Ein Temperaturanstieg von 30 auf 37 °C hat den k_La kaum beeinflusst. Dennoch wurde für jedes untersuchte Füllvolumen eine individuelle Korrelation für 30 und 37 °C ermittelt. In Abb. 2 ist dies für Schüttelkolben mit Schikanen bei 30 °C mit 10 % Füllvolumen gezeigt. Eine optimale Parametersch?tzung konnte durch Gau?-Anpassung der k_La-Werte für Schikanenkolben und parabolische Anpassung von k_La-Werten für Kolben ohne Schikanen erreicht werden.

Wachstum und Sauerstoffverbrauch von C. glutamicum

Abbildung 3A zeigt das Wachstum und den Sauerstoffverbrauch von C. glutamicum Kultur in 250 ml Schüttelkolben bei 30 % Füllvolumen und 150 U/min Schüttelfrequenz. Dabei wurde beobachtet, dass DO sehr schnell abfiel und nach 4 Stunden limitierend wurde. Wachstum und Sauerstoffaufnahme wurden zu 0,38 h^-1 bzw. 14,2 mmol g^-1 h^-1 bestimmt. Diese Werte wurden verwendet, um den zeitlichen Verlauf des Zellwachstums und des DO für C. glutamicum Kultivierung bei einem anderen, bisher nicht getesteten Zustand vorherzusagen. Dazu führten wir Berechnungen für einen Versuchsaufbau in 250 ml Schüttelkolben mit Schikanen mit 10 % Füllvolumen und einer Schüttelfrequenz von 150 U/min durch. k_La wurde auf 190 h^-1 berechnet und mit einer Inokulumkonzentration von 0,2 g CDW l^-1 wurde der zeitliche Verlauf des Zellwachstums bestimmt, wie in Abbildung 3 B dargestellt ist (durchgezogene blaue Linie); unter Berücksichtigung aller Parameter wurde DO berechnet (gestrichelte blaue Linie). Bei der Durchführung des Experiments und der ?berwachung der Kulturleistung konnte nachgewiesen werden, dass der Sauerstoffverbrauch tats?chlich gut prognostiziert worden war. Experimentelle und vorhergesagte Werte waren fast identisch. Die erwartete Zellkonzentration bei limitierender Sauerstoffzufuhr (4,3 g l^-1) stimmte auch mit den experimentell erreichten Zellkonzentrationen von 4,6 ± 0,3 g l^-1 bei DO von 20 % überein.

Zusammenfassung

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich, dass diese Methode angewendet werden kann, um optimale Kulturbedingungen und Sauerstoffverbrauch in Einweg-Schüttelkolben vorherzusagen. Mit den ermittelten Korrelationen kann die kLa-Berechnung vom pufferbasierten System auf die Standard-Schüttelkolbenkultur übertragen werden. Die M?glichkeit, die Sauerstoffverfügbarkeit für bestimmte Versuchsanordnungen vorherzusagen, kann das Design of Experiment erheblich verbessern. Das SFR-System wurde speziell für die Sauerstoffüberwachung in Einweg-Schüttelkolben entwickelt und erwies sich bei dieser Untersuchung als ein wertvolles Werkzeug, das die grundlegenden Daten für die Entwicklung dieser neuen Methode und deren sp?tere Verifizierung lieferte.

Applikationsbericht nach
[1] S. Schiefelbein et al., Biotechnol Lett, 2013: Oxygen supply in disposable shake-flasks: prediction of oxygen transfer rate, oxygen saturation and maximum cell concentration during aerobic growth.