Entwicklung eines geschüttelten Scale-Down Modells

Charakterisierung kritischer Parameter in der Bioprozessentwicklung

Wir haben für ein bereits etabliertes Stirred-Tank-Modell im 2-Liter-Ma?stab ein geschütteltes Scale-Down Modell im ca. 0.1-Liter-Ma?stab entwickelt. Die Online-?berwachung des pH-Werts und der gel?sten Sauerstoffkonzentration im geschüttelten Scale-Down Modell wurde mit dem SFR Shake Flask Reader von PreSens durchgeführt. Obwohl nur eine einfache, manuelle Kontrolle dieser beiden Parameter realisiert werden konnte, erzielte das geschüttelte Scale-Down Modell ?hnliche Daten für die lebensf?hige Zelldichte, den spezifischen Glykosylierungsgehalt und das Ionenaustausch-Chromatographie-Muster wie das Stirred-Tank-Modell. Diese Ergebnisse legen nahe, dass für diesen Prozess die Bedeutung der pH- und DO-Kontrolle übersch?tzt werden k?nnte und dass weitere Untersuchungen durchgeführt werden müssen, um den Einfluss von Scherspannung und Energiezufuhr in beiden Modellen zu bewerten und zu vergleichen.

Scale-Down-Modelle werden verwendet, um den nachgewiesen akzeptablen Bereich kritischer Parameter und Einstellungen in der Bioprozessentwicklung zu charakterisieren. Auf diese Weise k?nnen Kosten und Zeit eingespart und eine zuverl?ssige Skalierung in biotechnologischen Produktionsprozessen für pharmazeutische Wirkstoffe gew?hrleistet werden. Ein bereits etabliertes 2 l Scale-Down Modell für einen Produktionsprozess im 1.000-Liter-Ma?stab sollte nun weiter auf eine Schüttelflasche mit ca. 0,1 l Arbeitsvolumen verkleinert werden. Unterschiede in den Str?mungsmustern, der Leistungsaufnahme, der Sauerstoffübertragung, der Misch-Scherspannung, der Schaumbildung usw. müssen berücksichtigt werden, wenn versucht wird, dieses geschüttelte Modell in verkleinertem Ma?stab für einen Produktionsprozess im gerührten Bioreaktor zu erstellen. Durch die Verkleinerung des Stirred-Tank Prozesses ist es m?glich, die Anzahl paralleler Experimente zu erh?hen und gleichzeitig die Kosten zu senken. Zudem kann eine gr??ere Anzahl die Signifikanz von Prozesscharakterisierungsstudien erh?hen und eine bessere Modellqualit?t erreicht werden. Der SFR Shake Flask Reader von PreSens (Regensburg, Deutschland) wurde in diesen Experimenten verwendet, um den pH-Wert und die gel?ste Sauerstoffkonzentration in den Schüttelkolben zu überwachen. Das System verwendet chemisch-optische Sensoren, die am Boden der Schüttelkolben angebracht sind und nicht-invasiv mit dem SFR im Inkubator ausgelesen werden.

Ansatz zur Etablierung eines geschüttelten Scale-Down Modells

Der SFR wurde zur Online-?berwachung der beiden grundlegenden Prozessparameter pO₂ und pH im geschüttelten Scale-Down Modell eingesetzt. In dieser Studie wurde ein Produktionsprozess für einen rekombinanten monoklonalen Antik?rper durchgeführt. Vorl?ufige Tests zeigten, dass das pH-Profil einen signifikanten Einfluss auf die Leistung dieses Prozesses haben k?nnte. Da kein zuverl?ssiges System zur Online-pH-Kontrolle in Schüttelkolben verfügbar ist, wurde dies durch die Kontrolle des CO₂-Gehalts im Einlassgas des Inkubators oder durch Zugabe von Base zum Medium erreicht, falls der pH-Wert unter den Sollwert fiel. Wir berechneten ein vereinfachtes pH-Profil aus früheren Prozessabl?ufen im 2-Liter-Ma?stab und verwendeten es, um die Menge an manuellen Eingriffen im Schüttelkolben-Ma?stab zu reduzieren. Um die Vergleichbarkeit der beiden unterschiedlichen Ma?st?be zu gew?hrleisten, wurden die pH-Sonde im  2 l Bioreaktor und der chemisch-optische online Sensor getestet. Ein relativ konstanter Offset von ca. 0,2 pH-Einheiten wurden durch eine t?gliche Neukalibrierung beider pH-Messger?te kompensiert. Vor dieser Studie erstellten wir ein empirisches Modell für den Sauerstofftransfer als Funktion der Schüttelgeschwindigkeit und des Reaktionsvolumens auf der Grundlage von k_La-Messungen im Schüttelkolben-Ma?stab. Um den Sollwert von 15 % gel?stem Sauerstoff (DO) des 2-Liter-Ma?stabs zu erreichen, wurde die Schüttelgeschwindigkeit des Inkubators manuell angepasst. Ein akzeptabler Bereich zwischen 15 - 30 % DO wurde angestrebt, um die Anzahl manueller Eingriffe zu minimieren. Weiterhin wurde das kontinuierliche Zufuhrprofil des 2-Liter-Modells in eine intermittierende Fütterungsstrategie, mit einer Boluszufuhr pro Tag, auf den Schüttelkolben-Ma?stab übertragen.

Leistung des geschüttelten Scale-Down Modells

Ein Ziel war, vergleichbare pH- und DO-Profile im Schüttelkolben-Ma?stab zu realisieren, um eine ?hnliche Prozessleistung wie beim 2-Liter-Modell zu gew?hrleisten. Der pH-Wert in den Schüttelkolben lag im allgemeinen w?hrend der gesamten Kultivierung in einem Bereich von 0,05 pH-Einheiten des Sollwerts (Abb. 2A). Haupts?chlich nach Zugabe von Base und Nahrung überschritt der pH-Wert seinen Zielbereich, jedoch nicht l?nger als 6 Stunden. Eine weitere Ausnahme von diesem Bereich konnte w?hrend der Nachtphase am 3. Tag gemessen werden, als keine Kontrolle vorgenommen wurde. DO konnte mit nur drei manuellen Anpassungen pro Tag auf einen Bereich von 10 - 40 % reguliert werden (Abb. 2 B). Der Zielbereich wurde w?hrend der Tage 1 - 3 und danach t?glich für 2 - 12 Stunden überschritten. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das Schüttelkolbenmodell die vorgegebenen pH- und DO-Profile nicht realisieren konnte. Qualit?tsmerkmale wie die Lebendzellendichte (VCD), die Produktkonzentration, das Peakmuster der Ionenaustauschchromatographie (IEC) und die relative Menge spezifisch glycosylierter Antik?rperspezies wurden ebenfalls mit ihrem akzeptablen Bereich auf Basis der Werte des Modells im 2-Liter-Ma?stab verglichen. Das Scale-Down Modell erzielte ?hnliche Prozessprofile in Bezug auf VCD und IEC. Der spezifisch glykosilierte Antik?rperanteil überstieg den Zielbereich um nur 0,7 %, was jedoch aufgrund der Messgenauigkeit als unkritisch gilt. Die Produktkonzentration wurde w?hrend der Kultivierung im Schüttelkolben-Ma?stab überwacht und erreichte ca. 20 - 25 % h?here Werte. Diese Ergebnisse sind überraschend, wenn man bedenkt, dass die Kontrolle von pH und DO im Schüttelkolben-Ma?stab viel weniger genau war als beim 2-Liter-Modell. Es k?nnte sein, dass die Wichtigkeit der pH- und DO-Kontrollgenauigkeit übersch?tzt wird. Die Steuerung anderer Prozessparameter, wie zum Beispiel Leistungsaufnahme und Scherspannung, k?nnte viel wichtiger sein. Die Energiezufuhr in einem Schüttelkolben unter den verwendeten Bedingungen ist wahrscheinlich niedriger als in einem 2 l Rührkesselbioreaktor. Die lokale maximale Energiezufuhr im Schüttelkolben-Ma?stab ist viel geringer aufgrund der gleichm??igeren Energiezufuhr an der Kolbenwand verglichen mit der hohen Scherbelastung in der N?he einer Rührerschaufel im Bioreaktor. Sauerstofflimitierung und schlechtes Mischen im Schüttelkolben-Ma?stab, über die in der Literatur berichtet worden ist, konnten in diesen Experimenten nicht best?tigt werden, da in beiden Ma?st?ben ein ?hnliches Wachstum und eine ?hnliche Produktqualit?t erreicht werden konnte.

Zusammenfassung

Ein 2 l Stirred-Tank Modell für einen Produktionsprozess im 1.000-Liter-Ma?stab wurde weiter verkleinert. Das entwickelte geschütterte Scale-Down Modell bei ca. 0,1-Liter-Ma?stab verfügte über eine sehr einfache, manuelle pH-Wert- und DO-Konzentrationskontrolle, die durch Online-?berwachung der beiden Parameter mit dem SFR Shake Flask Reader umgesetzt wurde. Obwohl diese Kontrolle im Vergleich zu einem vollst?ndig online gesteuerten Rührkessel-Bioreaktor von viel geringerer Qualit?t war, konnten ?hnliche Daten für IEC-Muster, Glycosylierungsgehalt und lebensf?hige Zellendichte - wichtige Qualit?tsattribute - mit dem geschüttelten Scale-Down Modell erreicht werden. Andere Prozessparameter wie Leistungsaufnahme, Scherspannung und deren Einfluss auf die Prozessleistung im Scale-Down Modell müssen weiter untersucht werden.

Applikationsbericht nach
Puskeiler et al., 2011, Development of a shaken scale down mode in USP: From 1?000 L to 0.1 L scale, Poster CCE