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Entwicklung eines teilweise kontrollierbaren Systems im Shake-Flask-Ma?stab
Verbesserte Datenqualit?t aus Fed Batch Schüttelkolbenkultivierungen durch Minimieren von St?rgr??en überwacht mit dem SFR
Christian Klinger, Sylvia Baumann, Robert Puskeiler, und Alexander Jockwer
Roche Diagnostics GmbH, Pharma Biotech Production and Development, Penzberg, Deutschland
Das Hauptziel dieser Studie war die Entwicklung eines einfach zu handhabenden und teilweise kontrollierbaren Prozess-Kultivierungssystems im Schüttelkolbenma?stab. Zuerst wurde untersucht, wie St?rungen, wie die Entnahme der Kolben aus dem Inkubator zur Fütterung und Probenahme, die Kulturbedingungen und -ergebnisse beeinflussen. Ein Adapter wurde konstruiert, der eine automatische Medienzufuhr in die Schüttelkolben erm?glichte. Der Sauerstoffpartialdruck (pO2) und pH-Wert wurden online mit dem SFR Shake Flask Reader von PreSens überwacht, so dass Limitierungen erkannt und rechtzeitig angepasst werden konnten. Dieses "semikontrollierte" System reduzierte den Arbeitsaufwand deutlich und minimierte die St?rgr??en, wodurch zuverl?ssigere und repr?sentativere Daten für weitere Scale-Up Prozesse gewonnen werden konnten.
In der Bioprozessentwicklung werden Systeme in kleinem Ma?stab verwendet, um geeignete Zelllinien, Medien und Fütterungsraten auszuw?hlen, bevor teurere, kontrollierte Kultivierungssysteme in gr??erem Ma?stab zum Einsatz kommen. Die Vergleichbarkeit ist dabei immer noch ein Problem, da Prozessentwicklungen auf Daten beruhen müssen, die in unkontrollierten kleinen Kultivierungssystemen erzeugt werden. Schüttelkolben sind ein Kleinformat, das üblicherweise für S?ugerzellen-Suspensionskulturen eingesetzt wird. Inkubatoren, die durch Kohlendioxid(CO2)-Versorgung und Feuchtigkeitskontrolle eine geeignete Umgebung bereitstellen, werden verwendet, um einen ausreichenden Sauerstofftransfer und eine Homogenisierung der Zellsuspension durch geeignetes Mischen sicherzustellen. Um den Scale-Up Parametern zu entsprechen, k?nnen die Leistungseintr?ge durch Anpassen der Schüttelfrequenz und der Exzentrizit?t der Schüttelbewegung oder des Arbeitsvolumens der Schüttelkolben eingestellt werden. Da bisher kein zuverl?ssiges System zur automatisierten Fütterung und Probenahme im Schüttelkolben-Ma?stab zur Verfügung steht, ist es notwendig, die Flaschen aus dem Inkubator zu nehmen. Diese St?rungen k?nnen sich auf den Stoffwechsel und die Gesamtleistung der kultivierten Zellen auswirken. Jede St?rung k?nnte m?glicherweise die Vergleichbarkeit mit kontrollierten Systemen verringern, bei denen derartige St?rungen nicht auftreten. Deshalb wurde in dieser Studie der Einfluss verschiedener St?rungen auf die Kulturen sowie die Kulturumgebung im Inkubator untersucht. Um die Notwendigkeit, die Schüttelkolben aus dem Inkubator entnehmen zu müssen, zu umgehen und somit die Anzahl der St?rgr??en zu minimieren, wurde ein Prototypadapter entwickelt. Er erm?glicht eine automatische Zufuhr zu den Flaschen mittels kontinuierlicher Dosiersysteme auf Pump- oder Spritzenbasis. Darüber hinaus wurden pH und pO2 mit dem SFR Shake Flask Reader von PreSens online überwacht. Dieses System erm?glicht die nicht-invasive Messung der beiden Parameter in mehreren Schüttelkolben gleichzeitig, ohne sie aus dem Inkubator nehmen zu müssen.
Das teilweise kontrollierbare System im Shake-Flask-Ma?stab
Die Kultivierung von Antik?rper-produzierenden CHO-Zelllinien wurde in ISF1-X-Inkubatoren (Kühner AG) durchgeführt. Die Schüttelkolben, die für die pO2- und pH-?berwachung verwendet wurden, waren jeweils mit einem chemisch-optischen O2 und pH Sensor Spot an der inneren Bodenwand ausgestattet. Diese Sensoren wurden mit dem SFR nicht-invasiv ausgelesen. Das System ist über Bluetooth mit einem PC verbunden, so dass eine Online-?berwachung durchgeführt werden kann, ohne Kulturen aus dem Inkubator zu nehmen oder die Schüttelbewegung zu unterbrechen. Falls erforderlich, wurden Anpassungen an den Inkubatoreinstellungen für CO2 und Schüttelfrequenz vorgenommen. Der neu entwickelte autoklavierbare Schüttelflaschenadapter verfügt über ein Innengewinde für die Schüttelflasche selbst und ein Au?engewinde für die Entlüftungskappe. Eine Modifikation der Schüttelflasche selbst ist nicht notwendig. Das Zu- und Abführen von Flüssigkeiten kann über drei Ports erfolgen. In diesem Experiment wurde den Zelllinien mit dem Adapter und Pumpen kontinuierlich Substrat zugeführt.
Auswirkung von St?rungen und Systemleistung
Wie in Abbildung 3 gezeigt ist, kann die Wiederherstellung des CO2-Gehalts in der Inkubatorluft bis zu 10 Minuten dauern. Verwendet man mehrere Schüttelkolben und nimmt diese nacheinander zur Probenahme oder Fütterung heraus und stellt sie wieder zurück, kann dies zu anhaltend niedrigen CO2-Werten im Brutschrank führen. Der pH-Wert in den Schüttelkolben k?nnte dadurch beeinflusst werden. Die Temperatur der Kulturen in Schüttelkolben mit 125 ml und 250 ml fiel über 3 °C ab, wenn sie aus dem Inkubator entnommen und für 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen wurden. Dies sind nur zwei Beispiele dafür, dass manuelle Fütterung und Probenahme au?erhalb des Inkubators Ursache für Unstimmigkeiten sein k?nnen, da sie vielen Faktoren unterliegen, die nicht jedes Mal reproduziert werden k?nnen. Eine weitere signifikante Fehlerquelle ist die Probenahme selbst, da Volumen und lebensf?hige Zellen aus der Kultur entfernt werden. Im Gegensatz zu gr??eren Ma?st?ben, z. B. einem 2l-Bioreaktorsystem, bei dem die Entfernung von 1 ml Probe nur 0,2 % des Volumens betr?gt, würde die Entnahme der gleichen Menge in einem Schüttelkolben mit 50 ml Arbeitsvolumen 2 % betragen – vergleicht man die Werte, ist das ein Faktor von 10. Wenn die Fütterungsmengen nicht nach jeder Probenahme auf die neuen Suspensionsvolumina eingestellt werden, kann das die Leistung ver?ndern (siehe Abb. 4). Abbildung 5 zeigt Online-Daten für pO2 und pH, die mit dem SFR in den Schüttelkolbenkulturen gesammelt wurden. Limitierungen lie?en sich nachgewiesen, da es zu einem Anstieg des pO2 in der Zellsuspension kam, sobald die Gesamtsauerstoffaufnahme abfiel. Entsprechende Schritte konnten unternommen werden, um Limitierungen zu vermeiden. Das SFR half beim Aufbau eines teilweise kontrollierten Systems. Der neue Adapter behinderte den Sauerstofftransfer in die Schüttelkolben nicht und die automatische Zufuhr – die weniger St?rungen verursacht - erwies sich als erfolgreich. Zusammen mit dem SFR, der eine Beurteilung der Kultivierung und eine teilweise Kontrolle von Parametern erlaubte, konnten die St?rgr??en verringert werden. Das notwendige Frontloading durch Vorbereiten und Verbinden der Adapter mit den Schüttelkolben wurde durch automatische Zufuhr und weniger Probenahmen überkompensiert.
Zusammenfassung
Die Online-?berwachung von pO2 und pH mit dem SFR ist ein weiterer Schritt, um die Effizienz der Prozessentwicklung im Schüttelkolbenma?stab zu erh?hen. Der Adapterprototyp erm?glichte eine automatische Zufuhr und minimierte St?rungen, die einen signifikanten Einfluss auf die Kulturen haben k?nnen, wie in dieser Studie gezeigt wurde. Indem beide Ger?te zusammen verwendet werden, ist es m?glich, den Gesamtarbeitsaufwand pro Schüttelkolben zu verringern, wodurch ein h?herer Durchsatz erm?glicht und eine stabilere Kulturleistung sichergestellt wird. So werden für weitere Scale-up-Prozesse zuverl?ssigere und vergleichbare Daten gewonnen.