Tutorials, Webinare und informative Videos über unsere optischen Sensorsysteme
Genauer Einblick in den Sauerstoffgehalt von Schüttelkolben
Michael Findeis und Gernot T. John
PreSens GmbH, 93053 Regensburg, Deutschland
Zahlreiche Faktoren beeinflussen das Wachstum von Zellkulturen in Schüttelkolben. Der freie Sauerstoffgehalt spielt eine entscheidende Rolle. Unzureichender Sauerstoffeintrag aus der Umgebung schr?nkt das Wachstum ein. Mit dem neuen SFR-Messsystem kann der gel?ste Sauerstoffgehalt des Mediums nicht-invasiv und ?u?erst genau bestimmt werden. Kontinuierliche Sauerstoffüberwachung bietet Vorteile für die Kultivierung neuer empfindlicher Zelllinien, für die Medienoptimierung und für die QA-bezogene Prozesskontrolle.
Berührungslose Sauerstoffmessung
Schlüsselparameter in der aeroben Zellkultur sind der gel?ste Sauerstoffgehalt und der pH-Wert des Mediums, die beide die Kulturqualit?t entscheidend beeinflussen. Die beiden Werte ver?ndern sich im Verlauf der Zellkultur durch Sauerstoffverbrauch, und Ans?uerung des Mediums durch Stoffwechselprodukte. Die kontinuierliche ?berwachung von Sauerstoffverbrauch und pH-Wert ist für die Optimierung von Zellkulturprozessen von Vorteil. Wenn bestimmte Grenzwerte überschritten werden, k?nnen entsprechende Korrekturen, wie z.B. schnelle Medienwechsel oder Ver?nderung des Sauerstoffpartialdruckes, vorgenommen werden. Zuverl?ssige Informationen über den Stoffwechselzustand der Kultur sind essentiell für die Qualit?tssicherung. Die berührungslose Messung von Sauerstoffgehalt und pH-Wert mittels nicht-invasiven optischen Sensoren (1) steht nun auch für Schüttelkulturen zur Verfügung (Abb. 1), wodurch eine nachhaltige Verbesserung des Prozesses m?glich ist. Das optoelektronische SFR-Messger?t basiert auf chemisch-optischen Sensoren. Im Gegensatz zu den Vorg?ngersystemen bietet die neue SFR-Technik eine kombinierte Messung von DO und pH. Das Messprinzip des Sauerstoffsensors beruht auf der selektiven Aufzeichnung einfacher Sensorlumineszenz. Im pH-Sensor wird die Lumineszenz mittels eines dualen Signals mit einem zus?tzlichen integrierten Referenzsensor detektiert. Das Sensorauslesen erfolgt mit modulierten Signalen, so dass St?rungen durch farbige Medien und Fremdk?rper vermieden werden k?nnen. Die SFR-Ausleseeinheit besteht aus neun optischen Modulen zur gleichzeitigen Messung beider Parameter. Das System ist für Schüttelkolben mit 125, 250, 500, 1000, 2000, 3000 und 5000 ml Volumen geeignet. Das Komplettsystem kann einfach auf das Tray eines Standard-Schüttlers montiert werden und passt somit in die meisten Schüttel-Vorrichtungen. Messdaten werden kabellos in Echtzeit übertragen. Da alle Systemkomponenten vorkalibriert sind, ist keine weitere Kalibrierung vor Ort erforderlich.
Pilotstudie mit Hefezellen
Eine Pilotstudie an Hefezellkulturen demonstriert die Leistungsf?higkeit der neuen Messtechnik. Von besonderem Interesse ist der Einfluss unterschiedlicher Schüttelfrequenzen und Füllvolumina auf den Sauerstoffgehalt w?hrend der dynamischen Wachstumsphase.
Dynamische Wachstumsphase
Die ?nderung der Schüttelfrequenz beeinflusst den gel?sten Sauerstoffgehalt (DO) der Probe. Ein einfacher Testaufbau mit stufenweiser Erh?hung der Schüttelfrequenz über einen Zeitraum von zwei Stunden zeigte dies deutlich (Abb. 4). Ab dem Grundwert von 100 U / min wurde die Frequenz alle 15 Minuten um 25 U / min erh?ht. Nachdem die maximale Frequenz von 300 U / min erreicht worden war, wurde die Inkubation bei 100 U / min fortgesetzt. Das Schüttelprogramm begann, als der optische Dichtegradient ΔOD 0,4 erreichte, um sicher zu stellen, dass die Messreihe w?hrend der exponentiellen Wachstumsphase aufgezeichnet wurde (Abb. 4). Um die Wirkung des Füllvolumens auf den DO-Gehalt parallel zu bestimmen, wurden Messungen in Schüttelkolben (250 ml) mit unterschiedlichen Füllvolumina (12,5, 25 und 50 ml) durchgeführt. Die Ergebnisse für identische Proben (n = 3) stimmten gut überein. Jede Zunahme der Schüttelfrequenz (Abb. 3b) führte zu einer betr?chtlichen Zunahme des DO-Gehalts, was bei Proben mit einem Füllvolumen von 50 ml am st?rksten und bei niedrigeren Füllvolumina weniger ausgepr?gt war. Nach jeder Frequenzerh?hung hatte sich der DO innerhalb weniger Minuten auf ein neues h?heres Niveau eingependelt - allerdings nur für kurze Zeit, bevor er wieder abfiel. Diese Beobachtung l?sst sich darauf zurückführen, dass ein neues Gleichgewicht zwischen der Menge an zugeführtem Sauerstoff und dem von der Kultur verbrauchten Sauerstoff schnell erreicht wurde.
Verbesserter Kultivierungsprozess
Das SFR-System ist ein ideales Werkzeug zur schnellen und berührungslosen Bestimmung des zellspezifischen Sauerstoffmetabolismus. Auch bei langen Messreihen und hohen Schüttelfrequenzen k?nnen verl?ssliche Aussagen über DO-Ver?nderungen in der Kultur über die Zeit gemacht werden. Dies gilt in gleicher Weise für die Online-Messung des pH-Wertes. Bei komplexen Kultivierungsvorg?ngen sorgt diese ?berwachungsfunktion für maximale Zuverl?ssigkeit und verbessert die Prozesseffizienz. Die durchgeführte Pilotstudie zeigt das gro?e Potenzial und die Vielzahl m?glicher Anwendungen einer Online-Sauerstoffbestimmung. Der Vorteil liegt darin, dass das Kultivierungssystem für die Messung nicht gest?rt werden muss. Dadurch wird die O2-?bertragung zu den Zellen nicht unterbrochen, und vorübergehend anaerobe Bedingungen k?nnen vermieden werden. Schlussfolgerungen, die zur weiteren Optimierung des Kultursystems herangezogen werden k?nnen - hinsichtlich Schüttelfrequenz, Probenvolumen, erforderlicher Kulturdauer, Medienzusammensetzung, Medienwechselzeiten, optimalen Erntezeiten und m?glicherweise auch metabolisch bedingten Hemmungsmechanismen in der Kultur durch Nebenprodukte – k?nnen direkt aus den Messdaten entnommen werden. Das nicht-invasive Messprinzip hat auch besondere Vorteile für die Kultur von Vertebraten-Zelllinien. Es reduziert das Kontaminationsrisiko. Der SFR ist ein effektives Werkzeug für die kostengünstige Entwicklung neuer Zelllinien, für zuverl?ssige Screening-Prozesse, Medienoptimierung und Vorversuche im Rahmen des Prozess-Scale-Ups.
1. Karin Benz und Jürgen Mollenhauer (2008), Quality Assessment in 3D Cultures of Disc-Chondrocytes: Optosensoric Online Monitoring of Oxygen and pH Kinetics, BioProcess International Vol. 6 (11), pp. 54 - 59.