Integration eines PreSens Sauerstoff-Sensorspots in einen massiven Mini-Bioreaktor

Validierung eines neu entwickelten Sensoradapters

Dieser Bericht beschreibt die Arbeitsweise eines Sensoradapters mit PreSens Sensortechnologie zur Messung der Umgebungsbedingungen in einem nicht transparenten, soliden Mini-Bioreaktor. Mit diesem Ansatz kann der Bioreaktor leicht gehandhabt werden. Verschiedene Arten optischer Sensoren (O₂, pH oder CO₂) k?nnen bei Bedarf schnell eingesetzt oder ausgetauscht werden, ohne den Bioreaktor selbst zu modifizieren.

Die Abteilung Zelltechniken und Angewandte Stammzellbiologie der Universit?t Leipzig hat einen Mini-Bioreaktor (Durchmesser: 69 mm, H?he: 39 mm) entwickelt, um die in vitro Produktion von hyalinen Knorpeltransplantaten [2] zu untersuchen und zu steigern. Zu diesem Zweck ist es notwendig, ausgew?hlte Parameter des Zellkulturmediums, das die Transplantate innerhalb des Bioreaktors umgibt, zu kontrollieren und zu messen. W?hrend beispielsweise eine Abnahme des pH-Werts eindeutig auf eine Infektion hinweisen k?nnte, würde eine Abnahme des gel?sten Sauerstoffs eine erh?hte Zellaktivit?t zeigen. Neben der Beziehung zur Zellvitalit?t kann die Sauerstoffrate eine feste Bedingung sein. Im Gegensatz zu Blut, wo die Sauerstoffspannung bei etwa 20 % liegt, betr?gt sie im Knorpel des menschlichen Knies nur 1 – 6 % [1]. Um Versuche mit verschiedenen vordefinierten Sauerstoffspannungen durchzuführen, muss dieser Parameter überwacht werden. Aus mehreren Gründen besteht der Bioreaktor aus einem nicht transparenten Thermoplast. Um chemisch-optische Sensoren zu verwenden und die Sensorreaktion nicht-invasiv mit dem jeweiligen Sauerstoffmessger?t von au?en zu lesen, w?re ein optisches, transparentes Fenster erforderlich. Um dies zu realisieren, wurde ein Sensoradapter (Abb. 1) entwickelt, der am Bioreaktor befestigt werden kann. Zwei Experimente wurden durchgeführt, um den Bioreaktor in Kombination mit dem Sauerstoffsensoradapter zu bewerten. Der erste Test zeigte das dynamische Verhalten des Sensors, wenn ein Sauerstoffabsorber zu einer Flüssigkeit innerhalb des Bioreaktors hinzugefügt wurde. Das zweite Experiment zur Simulation einer sehr hohen Zellaktivit?t wurde durchgeführt, um die F?higkeit der Bioreaktoren, die Sauerstoffspannung der Flüssigkeit zu erh?hen, zu best?tigen.

Um verschiedene Bedingungen zu simulieren, wurde der Bioreaktor (Abb. 2) so entworfen, dass mechanische Kr?fte auf die Transplantate ausgeübt werden k?nnen, das Kulturmedium erneuert werden kann - was zus?tzlich Scherkr?fte verursacht - und sich der Sauerstoffgehalt im Inneren kontrollieren l?sst. Die Kompression der Transplantate - um die Zellaktivit?t anzuregen - erfolgt durch einen Dehnungsaktor mit einer diskoidalen Platte, die an der transparenten und flexiblen Silikonmembran des Deckels befestigt ist. Von oben wird ein externer Antrieb magnetisch an den Aktor angedockt und regelt seine vertikale Position. Ein positiver Nebeneffekt der mechanischen Stimulation ist die Verwirbelung des Kulturmediums. Dadurch kann man von einer ausgewogenen Verteilung von gel?sten Gasen und N?hrstoffen im Medium ausgehen. Das unterste Paar der Ein- und Ausl?sse an der Seite des Bioreaktors dient zum Mediumaustausch, w?hrend das obere Paar zum Einstr?men von Gas dient, das in das Medium diffundiert. Wie die meisten Teile des Bioreaktors besteht der Sensoradapter aus dem biokompatiblen Thermoplast TECAPEEK?. Ausgestattet mit einem M8-Gewinde ist er seitlich am Bioreaktor in H?he des Transplantates angebracht. Eine Glasscheibe (BOROFLOAT?; Durchmesser: 5 mm, H?he: 1,75 mm) ist mit Silikon an der Vorderkante des Adapters befestigt. Der verwendete Sauerstoff-Sensorspot (Typ SP-PSt3-YAU-D5-YOP, PreSens GmbH) wird mit SG1-Silikonkleber auf der Glasscheibe fixiert. Die Kunststofflichtleitfaser (POF), die Anregungslicht zum Sensor und die Sensorantwort zum Sauerstoffmessger?t (Fibox 3, PreSens GmbH) übertr?gt, kann für nicht-invasive Messungen an der gegenüberliegenden Seite der Glasscheibe in den Adapter eingeführt werden. Eine Abdeckschraube fixiert die POF sehr eng an der Glasscheibe. Beide Experimente wurden mit 17 ml eines üblichen Kulturmediums (DMEM) durchgeführt, bei dem es sich um eine Zusammensetzung aus Salzen, Vitaminen, Aminos?uren und Glucose handelt. Das Podest und die Transplantate wurden für diese Tests nicht im Bioreaktor angebracht. Zum Vergleich von DMEM mit einer anderen Flüssigkeit wurde entmineralisiertes Wasser verwendet. Für das Oxygenierungsexperiment wurde ein Gasgemisch mit einer Zusammensetzung von O₂ (20%), CO₂ (5%) und N₂ (75%) eingestr?mt, und die Entfernung von O₂ aus den Flüssigkeiten erfolgte durch Zugabe von 2 g Natriumsulfit (Na₂SO₃): 2 Na₂SO₃ + O₂ -> 2 Na₂SO₄

Abbildung 3 zeigt den Unterschied in der Sauerstoffabnahme für Wasser und DMEM im ersten Experiment, wenn die gleiche Menge an Na₂SO₃ zugegeben wurde. Nach 5 Minuten wurde der Dehnungsaktor des geschlossenen Bioreaktors gestartet, um die chemische Reaktion zu beschleunigen. Geht man von einer exponentiellen Abnahme des Sauerstoffs aus, unterscheidet sich die Zeitkonstante für Wasser (3 min) und DMEM (100 min) um einen Faktor von mehr als 30. Der Grund dafür k?nnte eine viel langsamere L?slichkeit von Na₂SO₃ in DMEM sein, da keine Ver?nderungen festgestellt werden konnten bis durch den Dehnungsaktor eine Verwirbelung verursacht wurde. Abbildung 4 zeigt die zyklische, dreiminütige Oxygenierung von Na₂SO₃-ges?ttigtem DMEM mit 20 % O₂, die mit 200 ml/min alle 30 Minuten durchgeführt wurde. Das Na₂SO₃ war immer noch dabei sich aufzul?sen, so dass der O₂-Gehalt tendenziell abnahm. Aber der schnelle Effekt der Oxygenierung l?sst sich deutlich erkennen. Zusammenfassend ergaben beide Experimente, dass der Sensoradapter keine Einschr?nkungen in Bezug auf Handhabung und Leistung des Bioreaktors verursachte. Der PreSens Sauerstoffsensor ist in diesem Aufbau voll funktionsf?hig, mit ausreichend dynamischem Verhalten. Zum einen sorgt eine Amplitude des Sensorsignals zwischen 30.000 und 70.000 für eine stabile und pr?zise Messung und zum anderen wird der Bioreaktor als ein geschlossenes und steriles System nicht durch den Adapter gest?rt.

Referenzen
[1] Gibson J. S., Milner P. I., White R., Fairfax T. P. A., Wilkins R. J.: Oxygen and reactive oxygen species in articular cartilage: modulators of ionic homeostasis. Pflüger Archiv - European Journal of Physiology 455 (2007), Nr. 4, 563 - 573
[2] Schulz R. M., Wüstneck N., van Donkelaar C. C., Shelton J. C., Bader A.: Development and validation of a novel bioreactor system for load- and perfusion-controlled tissue engineering of chondrocyte-constructs. Biotechnology and Bioengineering 101 (2008), Nr. 4, 714 - 728