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Integration chemisch-optischer pH- und Sauerstoffsensoren in bestehende Steuerger?te
Kultivierungsüberwachung in einem Glasbioreaktorsystem mit nachtr?glich integrierten Sensorspots
Cedric Schirmer1, Vivian Ott1, Gernot T. John2, Dieter Eibl1
1Züricher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, School of Life Sciences and Facility Management, Institut für Chemie und Biotechnologie, W?denswil, Schweiz
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
Der Einsatz chemisch-optischer Sensoren zur Kultivierungsüberwachung in Bioreaktoren mit einer bereits vorhandenen Steuereinheit erfordert die Eingabe zus?tzlicher Messsignale. Zu diesem Zweck muss das digitale Signal oft in ein analoges Signal umgewandelt werden. Dies erreicht man, indem man die Online-Messdaten der Sensoren für pH und gel?sten Sauerstoff (DO) mit der Software PreSens Measurement Studio 2 erfasst, über einen Complementary Straight Binary Converter (CSB) konvertiert und an die Steuereinheit übertr?gt. Die an die Steuereinheit gesendeten Signale k?nnen dann zur ?berwachung und Steuerung von pH- und DO-Profilen verwendet werden. Die genaue und korrekte Funktionsweise des Versuchsaufbaus konnte in Versuchen mit Chinese Hamster Ovary (CHO) und Escherichia coli Zellen überprüft werden und sollte auch in Kombination mit anderen Bioreaktorsystemen und Steuerger?ten verschiedener Hersteller einsetzbar sein.
Chemisch-optische Sensoren erm?glichen eine nicht-invasive ?berwachung des Sauerstoffgehalts und des pH-Wertes in Bioreaktoren und haben sich in den letzten Jahren in Einwegsystemen bew?hrt. Wenn die Sensorspots einem durch Polymerfasern übertragenen Lichtsignal ausgesetzt sind, wird ein Messsignal erzeugt, das von der entsprechenden Software in digitaler Form ausgewertet werden kann. Viele Steuerger?te sind immer noch für den Betrieb mit herk?mmlichen elektrochemischen Sonden ausgelegt. Um die chemisch-optischen Sensoren für die Kultivierungsüberwachung einsetzen zu k?nnen, bietet PreSens OEM-L?sungen wie Elektrooptische Module (EOM) und Standalone-L?sungen für die Sauerstoff- und pH-Messung an, die in Steuerger?te integriert werden k?nnen. Die Systeme k?nnen an einen Computer angeschlossen werden, auf dem die PreSens Measurement Studio 2 Software ausgeführt wird. Diese ist leicht zu bedienen und erm?glicht es, die Sensorspot-Signale zu kalibrieren und auszulesen, und Messdaten aufzuzeichnen. Durch die Verwendung einer Softwareerweiterung und Integration eines 2-Kanal-CSB-Wandlers kann das digitale Messsignal in analoger Form an ein Universalsteuerger?t mit verfügbaren analogen Eing?ngen übertragen werden. Dieser Versuchsaufbau wurde durch Kultivierung mit E. coli (Daten nicht gezeigt) und CHO-Zellen verifiziert.
Material & Methoden
Versuchsaufbau
Der in Abbildung 2 gezeigte Versuchsaufbau wurde verwendet, um die Sensorspot-Signale an die Steuereinheit zu übertragen. Im ersten Schritt wurden der pH-Spot (SP-LG1-SA) und DO-Spot (SP-PSt3-YAU) im unteren Teil des gerührten Glasbioreaktors an der Innenwand angebracht. Polymerfaserkabel wurden von au?en über die Glasbioreaktorwand indirekt mit den Sensoren verbunden (1). Um Messsignale zu generieren und zu übertragen, wurden ein EOM-pH-LG1-mini und das Standalone-Ger?t Fibox 4 (beide von PreSens, Deutschland) und die anderen Enden der mit den Sensoren verbundenen Polymerfaserkabel gekoppelt (2). Die von EOM-pH-LG1-mini und Fibox 4 erfassten Messsignale wurden über eine USB-Schnittstelle an einen Computer übertragen, auf dem die Software PreSens Measurement Studio 2 ausgeführt wurde (3). Die Software wurde verwendet, um die Daten in einem Intervall von 30 Sekunden (einstellbar in einem Bereich von 1 Sek. bis zu mehreren Stunden) zu sammeln und aufzuzeichnen und die Sensorspots zu kalibrieren. Zur Umwandlung der digitalen Signale wurde zus?tzlich ein 2-Kanal-CSB-Wandler (PreSens, Deutschland) über USB mit dem Computer verbunden (4). Zu diesem Zweck wurden in der PreSens Measurement Studio 2 Software den einzelnen Sensoren Ausganskan?le zugeordnet, um die Datenübertragung auf den jeweiligen Kanal des 2-Kanal-CSB-Wandlers zu gew?hrleisten. Die analogen Signale im Bereich von 4 bis 20 mA, die am jeweiligen Ausgangskanal des CSB-Wandlers zur Verfügung standen, wurden an die analogen Eing?nge des Steuerger?tes (KLF, Bioengineering, Schweiz) weitergeleitet und zur Prozesskontrolle von pH und DO verwendet.
CHO-Zellkultur
Die CHO-Zellkultivierung wurde mit der CHO-Zelllinie XM111-10 (CCOS Nr. 837) durchgeführt. Diese Zelllinie hat einen Tetracyclin-regulierten Promotor, der die Expression des sekretierten alkalischen Phosphatase-Gens (SEAP-Gen) reguliert, das für die sekretorische alkalische Phosphatase kodiert [1]. Bei den durchgeführten Experimenten lag der Schwerpunkt auf der Massenvermehrung im Batch-Modus, so dass die Synthese von SEAP durch Erg?nzung des ChoMaster? HP-1-Mediums (Cell Culture Technologies, Schweiz) mit 2,5 mg l-1 Tetracyclin verhindert wurde. Weiterhin wurden dem Medium 0,2 % Pluronic F-68 zugesetzt. Der Bioreaktor wurde mit einer lebensf?higen Zelldichte von 0,5 × 106 Zellen ml-1 bei einem Kulturvolumen von 600 ml inokuliert und bei 37 ° C mit 0,44 vvm Oberfl?chenbelüftung (Prozessluft) kultiviert. Um einen Sauerstoffgehalt von ≥ 40 % und einen pH-Wert von ≤ 7,2 aufrechtzuerhalten, wurden Sauerstoff und CO2 nach Bedarf zugeführt. W?hrend des 4-t?gigen Kultivierungszeitraums wurde alle 12 Stunden eine Probe entnommen, um das Zellwachstum zu bestimmen. Darüber hinaus wurde der pH-Wert bei jeder Probenahme extern gemessen und gegebenenfalls neu kalibriert.
Kultivierungsergebnisse
Abbildung 3A zeigt ein Beispiel für die Entwicklung der lebensf?higen Zelldichte w?hrend einer CHO-Zellkultivierung. Bei einer anf?nglichen Inokulation von 0,4 · 106 Zellen ml-1 wurde nach einer 3-t?gigen Kultivierungsperiode eine maximale Zelldichte von 3,6 · 106 Zellen ml-1 erreicht, was mit früheren Ergebnissen vergleichbar ist [2]. Innerhalb der ersten 1,5 Kultivierungstage wurde eine exponentielle Wachstumsphase mit einer spezifischen Wachstumsrate von 0,042 h-1 beobachtet. Die resultierenden pH-Schwankungen zwischen 7,08 und 7,25 w?hrend dieses Zeitraums (Abb. 3B) waren auf das Fehlen eines geeigneten CO2-Massendurchflussreglers in Verbindung mit dem 30-Sekunden-Messintervall des chemisch-optischen Sensorspots zurückzuführen. Die anschlie?ende Abnahme des pH-Wertes, die bis zum 2. Tag andauerte, und die darauf folgende Zunahme bis zum 2,6 Tag verliefen erwartungsgem?? durch Laktatbildung und Katabolisierung. Danach wurde der pH-Wert bis zum Ende der Kultivierung zwischen 6,87 und 7,25 gehalten, wobei der gro?e Schwankungsbereich auf die oben genannten Gründe zurückzuführen ist. Der DO schwankte w?hrend der gesamten Kultivierung zwischen 30 % und 45 %. Wie erwartet verringerte sich die Lebensf?higkeit ab dem 3. Tag von 96 % auf 2 % aufgrund der Abnahme von Glucose und Lactat, woraufhin die Kultivierung am 4. Tag beendet wurde.
Zusammenfassung
Die Integration chemisch-optischer pH- und Sauerstoff-Sensorspots in eine bestehende Kontrolleinheit wurde mit CHO-Zellen in einem gerührten Bioreaktorsystem erfolgreich evaluiert. Der Versuchsaufbau, bestehend aus einem EOM-pH-LG1-mini-Modul und dem Standalone-System Fibox 4 in Kombination mit der Software PreSens Measurement Studio 2 und einem 2-Kanal-CSB-Wandler zur Prozesssteuerung, lieferte pr?zise Messungen w?hrend der Untersuchungen. W?hrend des gesamten Testzeitraums konnten keine funktionellen oder technischen Probleme festgestellt werden. Die Integration und Konfiguration des Versuchsaufbaus erfolgte innerhalb weniger Minuten und ist für den Einbau in verschiedene handelsübliche Bioreaktorsysteme und Steuerger?tekombinationen geeignet. Es ist erw?hnenswert, dass der verwendete Ansatz nicht nur für CHO-Zellen, sondern auch für E. coli-Zellen funktioniert (Daten nicht gezeigt).
Referenzen
[1] Mazur X, Fussenegger M, Renner WA, Bailey JE. Higher Productivity of Growth-Arrested Chinese Hamster Ovary Cells Expressing the Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27. Biotechnol Prog 1998;14:705–13. doi:10.1021/bp980062h.
[2] Schirmer C, Nussbaumer T, Sch?b R, P?rtner R, Eibl R, Eibl D. Development, Engineering and Biological Characterization of Stirred Tank Bioreactors. In: Yeh M-K, Chen Y-C, editors. Biopharmaceuticals, InTech; 2018, p. 87–108. doi:10.5772/intechopen.79444.