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Isch?mie-bedingte Zellsch?digung in extrakorporal konserviertem Gewebe
Neue Erkenntnisse mit einem neuartigen Perfusionsmodell unter Verwendung optischer pO2, pCO2 und pH Sensoren
C. D. Taeger1, W. Müller-Seubert1, R. E. Horch1, K. Pr?bst2, F. Münch3, C. I. Geppert4, T. Birkholz5, A. Dragu1
Lehrstuhl für Plastische und Handchirurgie1, Bioverfahrenstechnik2, Herzchirurgie3, Pathologie4, Anesthesiologie5, Friedrich-Alexander-Universit?t Erlangen-Nürnberg, Deutschland
Gewebe, das bei Transplantation oder rekonstruktiver Chirurgie frei transferiert wird, ist immer dem Risiko Isch?mie-bedingter Zellsch?digungen ausgesetzt. Diese Studie zielte darauf ab, verschiedene Verfahren unter Verwendung eines extrakorporalen Perfusions- und Oxygenierungssystems zu bewerten. In diesem System wurden Durchflusszellen mit integrierten O2-, pH- und CO2-Sensoren implementier, um das Perfusat bevor und nach dem es einen freien Muskellappen passiert hatte online zu überwachen. Darüber hinaus untersuchten wir die Expression von HIF-1 alpha als Hypoxie-Marker und des pro-apoptotischen Proteins Caspase-3 in den Skelettmuskellappen, um Verbesserungen der Gewebekonservierung durch die verschiedenen Verfahren zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen, dass eine luftges?ttigte L?sung dem freien Muskellappen ausreichend Sauerstoff zuführt, und eine erh?hte Expression von HIF-1 alpha und Caspase-3 durch in dieser Studie angewandte Verfahren verhindert werden kann.
W?hrend des letzten Jahrzehnts wurden zahlreiche Fortschritte auf dem Gebiet der Transplantationsmedizin erzielt. In diesem Zusammenhang hat nicht nur der Organerhalt, sondern auch die extrakorporale Gewebekonservierung enorme Fortschritte gemacht. In der rekonstruktiven Chirurgie stellt der freie Transfer von Skelettmuskeln ein standardisiertes mikrochirurgisches Werkzeug dar, z. B. bei der Rekonstruktion gesch?digter Extremit?ten. In 5 % aller F?lle k?nnen jedoch Komplikationen und sogar vollst?ndiges Versagen aufgrund partieller oder vollst?ndiger Nekrose des transplantierten Gewebes auftreten. Gewebesch?den, verursacht durch anhaltende Isch?mie nach der Entnahme des Lappens, sind immer noch einer der limitierenden Faktoren. Isch?mie beschreibt einen Zustand eingeschr?nkter oder vollst?ndig inhibierter Blutversorgung, der zu Sauerstoff- und N?hrstoffmangel führt. Niedrige Sauerstoffkonzentrationen verursachen nicht nur w?hrend der Dauer der Isch?mie, sondern auch nach der Wiederherstellung der Zirkulation Sch?den im Gewebe. Die Wiederzufuhr von Sauerstoff sowie anderer Komponenten verursacht die Freisetzung freier Radikale, die bereits entstandene Sch?den noch verschlimmern. In der Vergangenheit wurden verschiedene Ans?tze zur Optimierung der Sauerstoffversorgung des Gewebes w?hrend der Isch?mie durchgeführt. Momentan besteht das Standardverfahren für die Konservierung von Gewebelappen in der rekonstruktiven Chirurgie meistens darin, sie nach der Entnahme mit einer einzigen Spülung von Salzl?sung zu behandeln, gefolgt von einer Kühllagerung bis sie mit dem Blutkreislauf wieder verbunden werden. Diese Studie wurde durchgeführt, um mehr über den Einfluss verschiedener Parameter zu erfahren, die die Isch?mie-bedingte Zellsch?digung des stark Isch?mie-anf?lligen Skelettmuskels beeinflussen, und Schlussfolgerungen für m?gliche Anwendungen in der klinischen Routine ziehen k?nnten.
Material & Methoden
In dieser Studie wurden n = 24 Muskellappen verwendet. Nach der Entnahme wurden die vier Gewebelappen der Gruppe I ohne weitere Behandlung bei Raumtemperatur gelagert (Kontrollgruppe). In Gruppe II wurden Kanülen in die Arterie und Vene von fünf Lappen eingeführt und an das Perfusions- und Oxygenierungssystem angeschlossen (Abb. 1, schematisches Modell). Die Lappen der Gruppe II wurden unmittelbar nach der Entnahme für 60 min mit einer Kardioplegie-L?sung (Histidin-Tryptophanketoglutarat-L?sung) perfundiert. In Gruppe III erhielten fünf Muskeln eine arterielle Nadel, wurden unmittelbar nach der Entnahme mit einer einzigen Spülung von 10 ml Kardioplegie-L?sung behandelt und wurden dann weiter unbehandelt belassen. In Gruppe IV wurden Kanülen sowohl in der Arterie als auch in der Vene von fünf Gewebelappen eingeführt, um eine Verbindung zu unserem Perfusions- und Oxygenierungssystem zu erm?glichen. Die Lappen in Gruppe IV wurden mit einer heparinisierten kristalloiden Flüssigkeit - mit einer Osmolarit?t von 291 mOsm / Liter (Jonosteril?) - perfundiert und oxygeniert. In Gruppe V wurden fünf Lappen perfundiert und ?hnlich der Gruppe IV mit heparinisierter Kardioplegie-L?sung oxygeniert. Die konstante Perfusion wurde mit einer Flussraten-regulierenden Pumpe (Abb. 1, P1; Infusomat ? Space P, Braun Melsungen, Deutschland) und einem Fluss von 10 ml / min durchgeführt. Arterielle und ven?se Drücke wurden kontinuierlich überwacht. Die Oxygenierung mit Umgebungsluft erfolgte durch einen Neonatal-Oxygenator (Abb. 1, O; SAFE Micro?, Polystan, D?nemark) in einem Sekund?rkreislauf. Der Prim?rkreislauf entnahm dem Sekund?rkreislauf, der über eine eigene Pumpe verfügte, frisch oxygeniertes Perfusat (Abb. 1, P2). W?hrend der aktiven Perfusion wurden pO2, pCO2 und pH des Perfusats kontinuierlich auf der arteriellen (Abb. 1, pO2a, pCO2 a, pH a) und ven?sen Seite des Perfusionssystems (Abb. 1, pO2 v, pCO2 v, pH v) überwacht. Alle Parameter wurden mit optischen Sensoren, die in Durchflusszellen integriert sind und nicht-invasive Datenerfassung mit schneller Ansprechzeit erm?glichen, gemessen. Zum Auslesen der Sensoren waren die Durchflusszellen über Polymer-Lichtwellenleiter mit dem jeweiligen faseroptischen Messger?t verbunden (OXY-4 mini, pCO2 mini, pH-1 mini, PreSens, Deutschland). Die Datenerfassung wurde mit einer Rate von 4 min-1 durchgeführt. Die Verwendung von Durchflusszellen mit integrierten Sensoren erm?glicht die Parameterbestimmung ohne die Durchflussrate und Salzkonzentration in den Perfusaten zu beeinflussen. Um die Auswirkungen der verschiedenen Verfahren auf die Expression von Caspase-3 und HIF-1 alpha zu bestimmen, wurde 0 (Baseline), 15, 30 und 60 min nach der Explantation eine Biopsie durchgeführt. Biopsien wurden in Formalin bei Umgebungstemperatur gelagert, bevor sie in Paraffin eingebettet wurden. Aus dem vorbereiteten Probenblock wurde ein Objekttr?ger pro F?rbemethode entnommen.
Ergebnisse
Die Gewebelappen der Gruppen ohne Oxygenierung extrahierten den Sauerstoff w?hrend der Perfusion nahezu vollst?ndig, da der ven?se pO2 auf etwa 0 % sank (Abb. 2A). Im Gegensatz dazu stabilisierte die Zufuhr von 21 % O2 (Umgebungsluft) über einen Oxygenator den arteriellen pO2 und der pO2 im ven?sen Zweig blieb bei 5 % (Abb. 2B). Die Sauerstoffaufnahme des Gewebes führte auch zu unterschiedlichen CO2-Ausscheidungen in das Perfusat (Abb. 3A). W?hrend die maximale Differenz von ven?sem zu arteriellem pCO2 im Perfusat von Geweben ohne zus?tzlicher Sauerstoffversorgung nicht über 1 % hinausreichte, wurde mit Oxygenierung ein pCO2-Unterschied von anf?nglich 10 % gemessen, der selbst nach einer Stunde Perfusion noch einen mittleren Wert von 3,9 % aufwies. Arterielle und ven?se pH-Werte des Perfusats zeigten keine inkonsistenten Werte. Daher wurde ein mittlerer pH-Wert des Perfusats verwendet, um Perfusate in Gewebe mit und ohne zus?tzlicher Sauerstoffversorgung zu vergleichen (Abb. 3B). Beide Kurven zeigen eine leichte Erh?hung des pH-Wertes über die Perfusionszeit von einer Stunde. Die histologische Analyse zeigte, dass alle Verfahren (Gruppen II - V) im Vergleich zur Kontrollgruppe (Gruppe I) nach 60 min signifikant niedrigere Expressionsraten von Caspase-3 aufwiesen, wobei Gruppe IV (Perfusion und Oxygenierung mit einer kristalloiden L?sung) beste Ergebnisse erzielte (Abb. 4A). Ein signifikant niedrigeres Niveau von HIF-1 alpha im Vergleich zu der Kontrollgruppe (Gruppe I) konnte nach 60 min nur in Gruppen nachgewiesen werden, in denen die Lappen kontinuierlich entweder mit kristalloider oder Kardioplegie-L?sung perfundiert worden waren (Gruppen II, IV, V). Ein Vergleich der Kontrollgruppe (Gruppe I) mit den behandelten Gruppen (Gruppen II-V) best?tigt, dass alle Behandlungen (au?er einmalige Spülung mit Kardioplegie-L?sung, Gruppe III) die HIF-1 alpha-Expression verringerten (Abb. 4B).
Zusammenfassung
Unsere Daten legen nahe, dass es Methoden gibt, um erh?hte Expression von HIF-1 alpha und Caspase-3 w?hrend der Konservierung von Gewebelappen zu verhindern. Nicht-invasive Messungen mit den in unserem Perfusions- und Oxygenierungssystem integrierten Durchflusszellen und gleichzeitige ?berwachung von O2, pH und CO2 lieferten wertvolle Informationen über den Sauerstoffbedarf und die CO2-Exkretion des untersuchten Muskelgewebes sowie den pH-Wert des Perfusats. Zusammenfassend konnte eine Optimierung der Organ- und Gewebekonservierung mit einfachsten Mitteln durch eine nicht rezirkulierende Infusion realisiert werden. Eine luftges?ttigte L?sung ist in der Lage, den Sauerstoffbedarf eines freien Gewebelappens zu decken, und solange keine Rezirkulation stattfindet, ist eine zus?tzliche Sauerstoffzufuhr entbehrlich. Solche Methoden k?nnten in der klinischen Routine implementiert werden.
Applikationsbericht nach
C. D. Taeger et al. (2014): Ischemia-related cell damage in extracorporeal preserved tissue - new findings with a novel perfusion model, J. Cell. Mol. Med. 18: 885 - 894.
DOI: 10.1111/jcmm.12238