Messung von Sauerstoffgradienten über einer respiratiorisch aktiven Algenzellschicht

Einsatz von VisiSens? zur Erkennung dynamischer Sauerstoffluktuationen über die Zeit

Sauerstoffgradienten in Pufferl?sung oberhalb einer Monoschicht von Chlamydomonas reinhardtii wurden mit dem VisiSens? System visualisiert. Ziel des Experiments war es, zu bestimmen, ob atmende Zellen in der Lage sind, ihre Sauerstoffverbrauchsrate an die Sauerstoffverfügbarkeit in ihrer Umgebung  anzupassen. Die Zellen wurden sowohl unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt als auch in Pufferl?sungen mit entweder hohen oder niedrigen Acetatkonzentrationen gehalten. Die 2D-Bilder, die mit VisiSens? im Laufe der Zeit aufgenommen wurden, deuten darauf hin, dass der Sauerstoffverbrauch durch Atmung mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen in der Zellumgebung variieren kann. Es wurde jedoch festgestellt, dass die N?hrstoffverfügbarkeit einen viel st?rkeren Einfluss auf die Zellen hat als die Sauerstoffverfügbarkeit.

Molekularer Sauerstoff ist ein wesentliches Substrat für die Produktion von Atmungsenergie (ATP). Wenn die Verfügbarkeit von Sauerstoff für eine Zelle zu gering wird, behindert dies die ATP Produktion und kann schlie?lich zum Tod der Zelle führen. Obwohl Pflanzen in der Lage sind, Sauerstoff bei Licht durch Photosynthese selbst zu produzieren, sind Pflanzenzellen sehr anf?llig für Sauerstoffmangel. Da Pflanzen kein effizientes Verteilungssystem haben, um Sauerstoff zu den Geweben zu transportieren, in denen er am meisten ben?tigt wird, k?nnen interne Sauerstoffkonzentrationen in Pflanzen auf sehr niedrige Niveaus fallen.
Es wird beschrieben, dass Pflanzen mehrere adaptive metabolische Reaktionen auf Sauerstoffarmut besitzen. Die Aktivit?t des energieverbrauchenden Speicherstoffwechsels wird herunterreguliert, und metabolische Flüsse werden auf die ?konomischsten Abl?ufe umgestellt. Als Folge dieser metabolischen Anpassungen kann die Produktionsrate von ATP reduziert und der Sauerstoffbedarf der Zellatmung verringert werden. Gegenw?rtig wird diskutiert, ob diese Reduktion des Sauerstoffverbrauchs bei Hypoxie eine direkte Folge des Sauerstoffmangels ist, oder ob proaktive Regulationsmechanismen vorhanden sind, um Sauerstoff zu sparen und zu verhindern, dass die Zellen anoxisch (d. h. v?llige Abwesenheit von Sauerstoff) werden. Voraussetzung für eine proaktive Regulierung des Sauerstoffverbrauchs ist ein zellul?rer Mechanismus zur Bestimmung der Sauerstoffverfügbarkeit. Tats?chlich wurde kürzlich ein Sensor oder Signalweg für die Verfügbarkeit von molekularem Sauerstoff in Pflanzenzellen entdeckt. Es muss jedoch noch der experimentelle Nachweis erbracht werden, dass Pflanzenzellen Sauerstoff sparen k?nnen, indem sie ihren Verbrauch w?hrend Perioden geringer Sauerstoffverfügbarkeit reduzieren.
Da es nicht m?glich ist, die wahre Sauerstoffkonzentration in und um multizellul?re Pflanzengewebe zu bestimmen, ohne das Gewebe zu besch?digen, haben wir uns entschieden, für diese Experimente eine flüssige Zellkultur der Alge Chlamydomonas reinhardtii zu verwenden. Die VisiSens? Sensorfolie wurde an der Innenseite des Testgef??es angebracht, um Sauerstofffluktuationen im Medium über den Zellen zu bestimmen und zu untersuchen, ob atmende Pflanzenzellen in der Lage sind, ihre Sauerstoffverbrauchsrate an variierende Sauerstoffverfügbarkeit in ihrer Umgebung anzupassen.

Material & Methoden

Zellen eines unbeweglichen Stammes der Grünalge Chlamydomonas rheinhardtii wurden in zwei gerade Glasfl?schchen pipettiert. Innerhalb von etwa 4 Stunden bauten die Zellen eine homogene Zellschicht am Boden der Flasche auf. Der ?berstand wurde vorsichtig abpipettiert und durch einen Puffer mit entweder hoher oder niedriger Acetatkonzentration als Atmungssubstrat ersetzt. Die Testfl?schchen wurden im Dunkeln und  in einen transparenten Plastikbeutel platziert, der mit vorgemischter Luft gefüllt werden konnte, die unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen enthielt (siehe Abb. 1). Die Sauerstoffkonzentration in der Puffers?ule über den Zellen wurde kontinuierlich unter Verwendung eines kleinen Streifens VisiSens? Sauerstoff-Sensorfolie überwacht, die an der Innenseite des Glasfl?schchens angebracht war (siehe Abb. 2). Es wurden Sauerstoffkonzentrationen von 21 % (v / v) und 4 % (v / v) über den Luftstrom eingespeist und Messungen über 24 Stunden durchgeführt.

Innerhalb der Puffers?ule über der Algenzellschicht bildete sich ein Sauerstoffgradient, wenn die Sauerstoffkonzentration in der Luft um die Glasfl?schchen bei 21 % (v/v) gehalten wurde (siehe Abb. 3A). Die St?rke des Gradienten korrelierte nicht mit der Kohlenhydratn?hrstoffkonzentration in der Pufferl?sung. Wenn jedoch die Sauerstoffkonzentration um die Flasche herum auf 4 % (v / v) verringert wurde, fiel die Sauerstoffkonzentration im Puffer schnell ab und eine homogene Sauerstoffverteilung in der gesamten Flasche konnte aufgezeichnet werden. Interessanterweise blieb die Sauerstoffkonzentration in der Flasche, die mit einer niedrigen Acetatkonzentration versorgt wurde, h?her als in der Flasche mit hoher Acetatkonzentration. Offensichtlich führte die niedrige N?hrstoffkonzentration in Verbindung mit niedrigen Sauerstoffniveaus hier zu einer verringerten Sauerstoffverbrauchsrate im Vergleich zu den Zellen mit einer hohen N?hrstoffverfügbarkeit.

Zusammenfassung

Aus diesem Experiment kann gefolgert werden, dass die Rate des Sauerstoffverbrauchs durch Atmung abh?ngig von den Umweltbedingungen variieren kann, aber die N?hrstoffverfügbarkeit einen st?rkeren Einfluss als die Verfügbarkeit von Sauerstoff hat. Das VisiSens? System erm?glichte die Visualisierung von Sauerstoffkonzentrationen oberhalb der Algenzellschicht und die aufgenommenen Bilder erlaubten erste Rückschlüsse auf den Sauerstoffverbrauch in Pflanzenzellen. Das Ger?t ist einfach anzuwenden und kann bei der Untersuchung der Sauerstoffverbrauchsraten in Pflanzenzellen wertvolle Daten liefern. Besonders die M?glichkeit, Ver?nderungen nicht nur über l?ngere Zeitr?ume, sondern auch zweidimensional zu überwachen, ist ein gro?er Vorteil.