?berwachung der Sauerstoffversorgung in mikrofluidischen Zellkulturen mit 2D-Sensorfolien als Wachstumssubstrat (Vollversion)

Seit dem Aufkommen von Tiergewebe- und Zellkultur im Jahr 1912 haben sich die Schalen und sp?ter Flaschen, die zur in vitro Zucht und dem Erhalt von Zellen verwendet wurden, in ihrer Hauptgeometrie nicht wesentlich ver?ndert. Nichtsdestoweniger wurde die in vitro Kultur von tierischen und menschlichen Zellen zu einer Erfolgsgeschichte mit Anwendungen in den gesamten Life Sciences. Die Einführung von mikrofluidischen Vorrichtungen hat die Situation ver?ndert und diesem Bereich v?llig neue Konzepte und M?glichkeiten erschlossen, wie Zellen in Perfusion zu kultivieren, mit geringer Zellzahl zu arbeiten, Zellen einer genau definierten und variablen Scherspannung auszusetzten oder die direkte Kopplung mit Downstream-Analysesystemen, die in der Lage sind die Inkubationsflüssigkeit zu analysieren [1]. Mikrofluidische Vorrichtungen haben sich als vielseitige Plattformen etabliert, um verschiedene Zellkulturbedingungen oder Mikroumgebungen in 2D- und 3D-Gewebemodellen nachzuahmen. In letzter Zeit werden sie in so innovativen Bereichen wie der Analyse und Identifizierung von zirkulierenden Tumorzellen [2], der Stammzellenforschung und ?TAS-Ger?ten für die Zellanalyse eingesetzt. Mikrofluidik ist die Grundlage für Organ-on-a-Chip oder sogar Body-on-a-Chip Ans?tze, da sie es erlaubt, die entsprechenden Gewebe in Reihe oder parallel zueinander mit einer fluidischen Verbindung, ?hnlich der Situation im K?rper, zu platzieren. Aufgrund ihrer kompakten Architektur bieten mikrofluidische Chips viele Vorteile gegenüber der Standard-Well-Platten-Kultur, z. B. geringe Flüssigkeits- oder Probenvolumina, gute Prozesskontrolle sowie schnelle Analyse- und Reaktionszeiten. Die Mikrofluidik wird als eine "enabling technology" zur massiven Parallelisierung von zellbasierten Assays angesehen, die diese Ger?te für die Wirkstoffforschung im Allgemeinen und die Analyse mit hohem Durchsatz im Besonderen an Bedeutung gewinnen l?sst.
Die Sauerstoffverfügbarkeit in der zellul?ren Mikroumgebung beeinflusst stark den zellul?ren Ph?notyp und Metabolismus. Zum Beispiel ist bekannt, dass regernative Stamm- und Vorl?uferzellen in einem proliferativen Zustand bleiben, wenn sie in ihrer Sauerstoffnische gehalten werden [3], w?hrend erh?hte Sauerstoffkonzentrationen toxisch wirken und verringerte Sauerstoffkonzentrationen Zellsignalwege zur Differenzierung oder Apoptose aktivieren k?nnen. Das Gleichgewicht von Sauerstoffzustrom und Sauerstoffverbrauch bestimmt den Zustand der Mikroumgebung. Zellen in normalem Gewebe haben in Bezug auf Sauerstoff ihre spezifische Mikroumgebung die als Physoxie bezeichnet wird. Sie variiert von Kompartiment zu Kompartiment des K?rpers und reicht von etwa 13 % (v/v) O₂ in den Lungenalveolen bis zu fast 0 % (v/v) O₂ im Knochen. Trotz ihrer unbestreitbaren Bedeutung, ist die Oxygenierung der Mikroumgebung ein weitgehend übersehener Aspekt der meisten in vitro Systeme und wird nur von Experten auf diesem Gebiet berücksichtig. Das geringe Volumen in mikrofluidischen Chips und die potentiell geringe Verfügbarkeit von gel?stem Sauerstoff macht eine pr?zise Sauerstoffüberwachung noch bedeutsamer. Aber selbst unter den üblicherweise angewandten Zellkulturbedingungen in Standardbeh?ltern und Inkubatoren besteht eine erhebliche Diskrepanz zwischen der Oxygenierung in einem Zellkulturinkubator und der physiologischen Situation. Die meisten Zellkulturen werden immer noch mit einem Sauerstoffgehalt von ca. 19,9 % (v/v) O₂ in der Inkubationsatmosph?re durchgeführt. Dieser Gehalt resultiert aus der Verwendung von 95 % (v/v) Umgebungsluft (ca. 21 % (v/v) O₂) und 5 % (v/v) CO₂, das üblicherweise eingesetzt wird um den pH-Wert des Mediums auszugleichen. Diese Bedingungen werden als Normoxie bezeichnet, darunterliegende Sauerstoffniveaus beschreibt man als Hypoxie. Letzteres ist irreführend, da der Sauerstoffgehalt im menschlichen K?rper (Physoxie, siehe oben) niedriger ist als in normalen Zellkulturinkubatoren, und damit eher hypoxisch als normoxisch.

Betrachtet man das Gleichgewicht von Sauerstoffeinstrom und -verbrauch ist der Einstrom in mikrofluidischen Vorrichtungen der kritischste Parameter, und wird durch das mittlere Volumen, die Probengr??e und die Perfusionsrate gesteuert. Alle drei Faktoren sind experimentell kontrollierbar, w?hrend der Sauerstoffverbrauch der zu untersuchenden biologischen Organismen das nicht ist [4]. Ein detailliertes Verst?ndnis der Sauerstoffspannung in mikrofluidischen Vorrichtungen ist essentiell, um die in vitro Bedingungen in Zellkulturen der realen Physoxie anzun?hern und die Basis für reproduzierbarere und standardisierte Ergebnisse mit maximaler physiologischer Relevanz zu schaffen.
Der "Goldstandard" zur Messung von Sauerstoff ist die Clark-Elektrode mit einem amperometrischen Ausleseverfahren. Eine Clark-Elektrode erzeugt einen direkten Kontakt zwischen der Probe und der ?u?eren Umgebung, wodurch das Risiko einer Kontamination erh?ht wird. Gravierender jedoch ist, dass das elektrochemische Ausleseverfahren w?hrend der Messung Sauerstoff verbraucht, was bei der Untersuchung sehr kleiner Probenvolumina erhebliche Auswirkungen hat. Durch die Verwendung optischer Sauerstoffsensoren, l?sst sich dieser Nachteil umgehen. Diese beruhen auf dem Prinzip der dynamischen L?schung von Lumineszenzsonden. Sie sind klein, k?nnen in verschiedenen Formaten hergestellt werden und die Signale werden in Form sichtbaren Lichts aufgezeichnet, so dass die Datenerfassung von au?en, durch die transparenten W?nde der mikrofluidischen Chips, leicht zug?nglich ist. Lumineszenzsignale k?nnen in geschlossenen Kulturgef??en ohne irgendeine mechanische Verbindung ausgelesen, und St?rungen in der Probe somit minimiert werden. Lumineszenzsensorfarbstoffe k?nnen als freie Moleküle angewendet, in kleine Sensorpartikel eingebaut oder als planare Sensoren in ein Matrixmaterial eingebettet werden. Alle diese Formate haben individuelle Vorteile in Bezug auf Benutzerfreundlichkeit, Anwendbarkeit, Biokompatibilit?t und analytische Leistung. W?hrend molekulare Sensoren oder Sensorpartikel in mikrofluidischen Vorrichtungen leicht anzuwenden sind, indem sie zur Perfusionsflüssigkeit hinzugefügt werden, haben Sie dennoch einige Tücken und Nachteile. Molekulare Indikatorfarbstoffe als solche - oder nach der Integration in Nanopartikel - setzen zytotoxischen Singulett-Sauerstoff frei, der w?hrend der Messung in situ erzeugt wird und sich nachteilig auf die Zellkulturen auswirken und das Experiment beeinflussen kann. Darüber hinaus sind Farbstoffe und Nanosensoren potentiell anf?llig für starkes Photobleichen, was ihre Lebensdauer als funktionale Sensoren einschr?nkt. Der direkte Kontakt zwischen Sonde und Zelle wird oft ignoriert, ist aber zugleich Grund für zunehmende Bedenken, da sich Moleküle und Partikel in spezifischen Organellen oder zellul?ren Strukturen ansammeln k?nnen, die die Zellphysiologie und das analytische Auslesen beeinflussen k?nnen. Als Konsequenz k?nnen die untersuchten Zellen danach nicht für weitere Experimente verwendet werden, da sie mit der Sauerstoffsonde kontaminiert sind. Die Verwendung von planaren Sensoren mit immobilisierten Indikatoren überwindet all diese Nachteile, wenn die Zellen direkt auf der Oberfl?che des Sensors wachsen. Unter diesen Bedingungen liegt der Abstand zwischen Zellmembran und Sensor in einer Gr??enordnung von nur 20 bis 200 nm. Die Farbstoffe sind in einem biokompatiblen Matrixmaterial immobilisiert, das verhindert, dass Singulett-Sauerstoff mit der Probe in Kontakt kommt. Obwohl Lumineszenzsensoren für die Messung verwendet werden, bleiben die Zellen frei von jeglichen Markern und k?nnen danach wiederverwendet werden. Planare Sensoren sind so konzipiert, dass sie kein Austreten des Sensorfarbstoffes zulassen, wodurch sie biokompatibel sind, und die geschützte Umgebung innerhalb der Matrix sorgt gleichzeitig für eine deutlich verbesserte Photostabilit?t.
Planare Optoden für Sauerstoff k?nnen zur Inline-?berwachung verwendet werden, wenn sie in Durchflusszellen integriert mit dem Ein- bzw. Auslass einer mikrofluidischen Vorrichtung verbunden sind. Alternativ werden die Sensoren als Sensorspots innerhalb des Kanals oder in den Vorratsbeh?ltern angebracht, um den Sauerstoff darin zu überwachen. Für h?chste r?umliche Aufl?sung werden planare O₂ Sensoren als Bodenplatte mikrofluidischer Kanalstrukturen verwendet, so dass sie gleichzeitig als Sensor und als Wachstumssubstrat für die zu untersuchenden Zellen dienen. In Kombination mit einer geeigneten Kamera kann mit diesem Aufbau über die gesamte fluidische Struktur hinweg in 2D ausgelesen werden. Diese 2D-Anzeige erm?glicht die Visualisierung von Gradienten sowie die Untersuchung verschiedener relevanter Bereiche in einem Experiment. In dieser Studie pr?sentieren wir ein 2D-Auslesesystem, genannt VisiSens?, zusammen mit planaren optischen Sauerstoffsensorfolien, die in mikrofluidische Kan?le integriert sind, um die Oxygenierung in mikrofluidischen Zellkulturen zu untersuchen. Aufgrund (i) des geringen Abstandes zwischen Membran und Sensoroberfl?che, der durch Diffusion überbrückt werden muss, und (ii) der hohen O₂-Permeabilit?t der Zellmembran spiegelt der ausgelesene Wert den Sauerstoffgehalt des Zytoplasmas in guter N?herung wider.

Die sauerstoffempfindliche planare Sensorfolie vom Typ SF-RPSu4 (PreSens, Deutschland) wurde mit Silikonkleber auf einem Objekttr?ger befestigt. Der Objekttr?ger bietet eine harte, starre und optisch transparente Auflage. Eine Schutzschicht, die auf den kommerziell erh?ltlichen Sensorfolien aufgebracht ist, wurde mechanisch von der empfindlichen Seite der Folie entfernt, um die Zelladh?sion zu verbessern und den Abstand zwischen Zellen und Indikatorfarbstoffen zu verringern. Eine selbstklebende mikrofluidische Vorrichtung ohne Bodenplatte (sticky-Slide I, 0,4 Luer; ibidi, Deutschland) wurde auf die Sensorfolie geklebt, und so der endgültige mikrofluidische Zellkulturbeh?lter mit integriertem, planarem O₂ Sensor geschaffen. Der selbstklebende Mikrokanal hat eine H?he von 450 ?m, ein Kanalvolumen von 113 ?l und eine Wachstumsfl?che von 2,5 cm². In einem weiteren Experiment nutzten wir zum Vergleich ein offenes Kanalsystem ohne Abdeckung. Dafür wurde eine offene PDMS-Kultivierungskammer mit derselben Wachstumsfl?che von von 2,5 cm² und 1 ml Volumen auf die Sensorfolie geklebt. Die Kammer wurde im Inkubator mit einem Deckel zugedeckt um ein Verdunsten des Mediums zu verhindern. Das Auslesen des planaren Sensors erfolgte mit dem Sauerstoffbildgebungssystem VisiSens A1 (PreSens, Deutschland). Das Ausleseger?t ist ein über USB betriebener CMOS-Kameradetektor mit eingebauten Anregungs-LEDs und optischen Filtern. Die Sensorfolie wird mit blauem Licht angeregt und liefert rote und grüne Fluoreszenzemissionen. Die Lumineszenz der rot emittierenden Sonde ist empfindlich gegenüber der lokalen Sauerstoffkonzentration, w?hrend die grün emittierende Sonde gegenüber Sauerstoff unempfindlich ist und als interne Referenz dient, um Sonden-unabh?ngige Einflüsse auf die Emissionsintensit?t, wie z. B. Schwankungen der Intensit?t des einfallenden Lichts zu berücksichtigen. Das Verh?ltnis von roten und grünen Signalen liefert eine sauerstoffabh?ngige, ratiometrische Antwort in jedem Pixel innerhalb des Sichtfeldes. Eine Zweipunkt-Kalibrierung des Sensors wurde unter Verwendung von Zellkulturmedien mit 0 % (v/v) O₂ (Medium erg?nzt mit 10 g/l Na₂SO₃ zur Erzeugung einer sauerstofffreien L?sung) und 100 % Lufts?ttigung durchgeführt. Die automatische Zeitreihenerfassung und Auswertung der Sauerstoffbilder erfolgte mit der VisiSens AnalytiCal 1 Software (PreSens, Deutschland). Der vollst?ndige Aufbau ist in Abbildung 2 skizziert.
MDCK II Zellen wurden unter statischen Bedingungen gem?? den Empfehlungen des Herstellers bis zur Konfluenz im endgültigen Mikrofluidikchip gezüchtet, beginnend mit einer Zelldichte von 1,0 x 10⁵ Zellen cm^-2. Das regul?re Wachstumsmedium wurde zu Beginn des Experiments durch serumfreies L-15 Medium, dem internen Laborstandard für Testpuffer, ersetzt. 2D-Sauerstoffaufzeichnungen der Zellmikroumgebung unter statischen Bedingungen wurden 24 Std. nach dem Auss?en begonnen, wobei alle 5 Min. eine Messung gemacht wurde. Das Medium wurde in regelm??igen Zeitabst?nden nach Beginn der Sauerstoffmessung manuell ausgetauscht, indem 1 ml frisches L-15 Medium langsam durch den Kanal gespült wurde.

Zun?chst wurde die Biokompatibilit?t der Sensorfolie untersucht, indem MDCK II-Zellen in ?hnlicher Konzentration in regul?re Petrischalen (Referenz) aus für Zellkultur behandeltem Polystyrol und in Petrischalen mit einer auf den Boden der Schale geklebten Sauerstoffsensorfolie ausges?t wurden. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz gezüchtet und die Lebensf?higkeit der Zellen auf den verschiedenen Substraten durch eine etablierte Lebend-tot-F?rbung dokumentiert (Abb. 3). Dieses auf Fluoreszenz basierende Assay enth?lt zwei verschiedene Sonden: Calcein-AM und Ethidium-Homodimer. Ersteres f?rbt das Zytoplasma lebender Zellen hellgrün, w?hrend letzteres den Kern toter Zellen ,aufgrund der Interkalation des Farbstoffs in die DNA, durch rote Fluoreszenzemission markiert. Beide Proben zeigen ?hnliche Ergebnisse mit nur sehr geringen Mengen an rot emittierenden toten Zellen in der Monolayer (Pfeile in Abb. 3). Die Aufnahmen sind austauschbar und es gibt keine Hinweise auf das Vorhandensein der Sensorfolie. Somit ist die Biokompatibilit?t der O₂ Sensorfolien best?tigt und sie k?nnen als Ersatz für regul?re Zellkulturkunststoffe verwendet werden.

Die Oxygenierung innerhalb des mikrofluidischen Kanals und damit die Mikroumgebung der zellen wurde in einem Zeitreihenexperiment mit intermittierendem Austausch des Testpuffers untersucht. ?nderungen der r?umlichen 2D-Sauerstoffverteilung über die Zeit sind in Abbildung 4A als Falschfarbenbilder dargestellt. Die Pseudofarben kodieren die jeweiligen Sauerstoffpegel in jedem Pixel unterhalb der Zellschicht. Für die 2D-Sauerstoffaufzeichnungen wurde das verstellbare Sichtfeld des VisiSens A1 Systems so angepasst, dass die gesamte Kanalbreite abgedeckt war. Ein vergr??ertes Sichtfeld führt zu einer Verringerung der Bildaufl?sung und umgekehrt. Die Zeitreihen von Bildern zeigen einen lateral homogenen, schnellen Abfall des Sauerstoffgehalts innerhalb einer Stunde. Dieser ist das Resultat der Zellatmung in einem nicht durchstr?mten System aus Materialien (Kanal, Bodenplatte) mit geringer Sauerstoffpermeabilit?t. Der intermittierende Austausch des Zellkulturmediums bei 0 Std., 2,58 Std. und 5,25 Std. führt zu einer wiederholten, vollst?ndigen und homogenen Reoxygenierung des Kanals.
Durch Auswahl einer "Region of Interest" (ROI) k?nnen die zeitabh?ngigen ?nderungen der Sauerstoffwerte quantitativ verfolgt werden. Drei aufeinanderfolgende Sauerstoffprofile von MDCK II-Zellen, die innerhalb des Mikrokanals mit intermittierender Str?mung kultiviert wurden, aufgezeichnet in drei einzelnen Messungen, sind in 4B gezeigt. Nach Zugabe von frischem L-15 Medium erh?hte sich der pO₂ unterhalb der Epithelzellschicht auf normoxische Werte von etwa 150 Torr. Da die Zellen im Kanal Sauerstoff verbrauchten, ohne einen signifikanten O₂-Einstrom von au?erhalb, wurde eine überraschend schnelle Abnahme von 50 % pO₂ innerhalb von (0,3 ± 0,1) Std. nach dem Austausch von L-15 Medium beobachtet. Der pO₂ fiel innerhalb von (1,5 ± 0,2) Std. nach dem Mediumwechsel schnell auf hypoxische Werte unter 10 Torr ab. Die zeitabh?ngigen Sauerstoffprofile erm?glichen die Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) der untersuchten Zellen für diese genau definierten experimentellen Bedingungen, wie im n?chsten Paragraph gezeigt wird.

In weiteren Proof-of-Concept-Experimenten nutzen wir das offene mikrofluidische Kanalsystem mit integriertem O₂ Sensor, um den Effekt bekannter Wirkstoffe auf die Sauerstoffverbrauchsraten von Zellen im Kanal zu untersuche. Zwei Stoffe mit etablierten Wirkungsmechanismen zur Entkopplung oder Blockierung der oxidativen Phosphorylierung wurden mit dem zusammengesetzten Ger?t untersucht. Malonoben (Mal) wirkt als Entkoppler der Respiration und ATP-Produktion, w?hrend Antimycin A (Ant A) die Atmung blockiert. Wie bekannt ist, erh?hen Zellen ihre Sauerstoffverbrauchsrate, wenn sie Malonoben ausgesetzt werden, um die fehlende ATP-Synthese zu kompensieren. Im Gegensatz dazu stoppt Antimycin A den Sauerstoffverbrauch durch blockieren der mitochondrialen Atmung vollst?ndig. Das Experiment wurde in einem konsekutiven dreistufigen Verfahren durchgeführt und die Oxygenierung im Chip wurde mit der Zeit verfolgt (Abb. 5). Zuerst wurde der basale Sauerstoffverbrauch in L-15 Standardmedium bestimmt, gefolgt von einem Pufferaustausch nach 5 Stunden zu L-15 Medium erg?nzt mit 100 nM Mal (Abb. 5A) bzw. 2 ?M Ant A (Abb. 5B). Schlie?lich wurden die Zellen mit 1 ml frischem L-15 Medium behandelt, das 0,3 % (Gew./Vol.) Saponin enthielt, einem Reinigungsmittel, das bekannterma?en Zellen permeabilisiert. W?hrend der Grundverbrauchsaufzeichnung nahm der pO₂ aufgrund der Zellatmung innerhalb von etwa 0,75 Std. nach Beginn der Messung auf Werte unter 20 Torr ab, und die OCR in L-15 Medium wurde zu (26,9 ± 0,2) pmol s^-1 bestimmt (Abb. 5A) Der Austausch von L-15 Medium durch L-15 Medium versetzt mit 100 nM Malonoben (Abb. 5A a) wurde von einer vorübergehenden Reoxygenierung des Kanals auf einen Wert von (124 ± 5) Torr begleitet. Die entkoppelnde Wirkung von Mal führte jedoch zu einem noch schnelleren Verbrauch des zur Verfügung stehenden Sauerstoffs durch die Zellen, wie bereits aus der Literatur bekannt ist. pO₂ sank innerhalb von 0,25 Std. auf Werte unter 20 Torr. Der schnelle Sauerstoffverbrauch begrenzt die Genauigkeit der OCR-Bestimmung, die unter diesen Bedingungen zu (27,2 ± 0.1) pmol s^-1 berechnet wurde. Die Zugabe von Saponin zum Inkubationsmedium (Abb. 5A b) permeabilisierte die Zellmembranen, so dass die Zellatmung irreversibel gestoppt wurde. Dementsprechend führte die Reoxygenierung des Kanals zu zeitunabh?ngiger Normoxie.
Die basale Sauerstoffverbrauchsrate, bevor die Zellen dem Atmungsinhibitor Antimycin A ausgesetzt wurden (Abb. 5B), ergab (28,3 ± 0,1) pmol s^-1 in enger ?bereinstimmung mit den oben angegebenen Werten. Sobald die oxidative Phosphorylierung durch Ant A irreversibel blockiert war, ?nderte sich die Reoxygenierung des Kanals mit Austausch des Mediums nicht mehr und verblieb bei Werten von (159 ± 9) Torr. Die Zugabe von Saponin hatte wie erwartet keine signifikanten zus?tzlichen Auswirkungen. Dementsprechend sanken die OCR-Werte auf (4,1 ± 5,2 10^-2) pmol s^-1. Der gro?e Standardfehler zeigt die begrenzte Genauigkeit der Messung, da kaum Sauerstoff verbraucht wurde. OCR in Gegenwart von Saponin wurde formal zu (0,3 ± 0,2) pmol s^-1 bestimmt.

Bei den oben beschriebenen Messungen wurden die planaren O₂ Sensorfolien gleichzeitig als Sensor und Wachstumssubstrat für die Zellen verwendet. Unter diesen Bedingungen liegt der Abstand zwischen der unteren Zellmembran und dem Sensor in der Gr??enordnung von 20 bis 200 nm, abh?ngig vom Zelltyp. Aufgrund (i) dieses geringen Abstands zwischen Membran und Sensoroberfl?che, der durch Diffusion überbrückt werden soll, und (ii) der hohen O₂-Permeabilit?t der Zellmembran bietet diese Architektur eine relativ kurze Reaktionszeit des Sensors und die einzigartige laterale Aufl?sung, wenn man Sauerstoffgradienten untersuchen m?chte. Sensorfolien k?nnen jedoch auch zellfrei genutzt werden, um die Oxygenierung der Mikroumgebung neben den Zellen zu untersuchen. Abbildung 6 zeigt einen Vergleich der Sensorantwort, wenn die untersuchten Zellen direkt auf der Sensoroberfl?che wie in den oben beschriebenen Beispielen (schwarze Kurve) oder daneben (blaue Kurve) kultiviert werden. Die zeitabh?ngige Abnahme von pO₂ zeigt signifikante Unterschiede in diesen beiden experimentellen Situationen. Der Grund für die langsamere Abnahme von pO₂, wenn die Zellen neben der Sensorfolie wachsen, ist der zus?tzliche Diffusionsabstand zwischen den atmenden Zellen und dem Sensor sowie die Unterschiede in den Flüssigkeitsvolumina, die in beiden Anordnungen untersucht werden.

Unsere Studie zeigt, dass Sauerstoff direkt in mikrofluidischen Chips gemessen werden kann, indem Lumineszenzsensoren in das Wachstumssubstrat integriert werden. Diese markierungsfreie Messtechnik erm?glicht Messungen in sehr kleinen Volumina und ohne w?hrend der Messung den Analyten zu verbrauchen. Lumineszierende O₂ Sensoren k?nnen als kleine Sensorspots für kontinuierliche Einpunkt-Messungen oder als planare Sensorfolien für lateral aufgel?ste Studien, wie hier gezeigt, verwendet werden. Planare Sensorfolien erm?glichen ein quantitatives zweidimensionales Auslesen mit der Option, lokale Sauerstoffkonzentrationen und -gradienten in einem anpassbaren Sichtfeld zu analysieren, verschiedene Regionen zu vergleichen oder mehrere Experimente gleichzeitig in parallelen Kan?len zu überwachen. Im Hinblick auf die Oxygenierung von mikrofluidischen Zellkulturvorrichtungen muss das Gleichgewicht von Sauerstoffeinstrom und - verbrauch durch Atmung streng überwacht und eingestellt werden, da die meisten zur Herstellung mikrofluidischer Strukturen verwendeten Materialien nur eine sehr begrenzte Permeabilit?t für Sauerstoff aufweisen. Die Daten in dieser Studie zeigen, wie schnell die Mikroumgebung der Zellen unter statischen Kulturbedingungen hypoxisch wird, was einen gro?en Einfluss auf die Lebensf?higkeit und Proliferation der untersuchten Zellen hat. Die Kontrolle des O₂-Gehalts und eine gut angepasste Perfusion sind in diesem System unabk?mmlich, um den physiologischen Zellph?notypen und relevante Analysen von zellbasierten Assays so nahe wie m?glich zu kommen.

Referenzen:
[1] Mehling M, Tay S (2014) Micorfluidic cell culture. Current Opinion in Biotechnology 25/95: 85-102
[2] Guansheng D, Fang Q, den Toonder JMJ (2016) Microfluidics for cell-based high throughput screening platforms—A review. Analytica chimica acta 903: 36-50
[3] Wahyu W (2014) Effect of oxygen tension on proliferation and characteristics of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Biomarkers and Genomic Medicine 6(1): 43-48
     Celeste SM, Keith B (2008) The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function." Nature Reviews Molecular Cell Biology 9(4): 285
[4] Brennan MD, Rexius-Hall ML, Elgass LJ, Eddington DT (2014) Oxygen control with microfluidics. Lab Chip. 14(22):4305-18