Online CO₂ Monitoring in CHO Zellkultur

Die ?berwachung von Zellkulturparametern wie der Konzentration an gel?stem Sauerstoff, dem pH-Wert und der Konzentration an gel?stem CO₂ ist wichtig, um die Produktqualit?t und -ausbeute sicherzustellen. Kleine Ver?nderungen in der Kulturumgebung k?nnen den Zellstoffwechsel, die Lebensf?higkeit und sogar das Glykosylierungsmuster von mABs beeinflussen. In S?ugetierzellkulturen werden typischerweise niedrige Begasungsraten angewendet, um zu verhindern, dass das Medium sch?umt und die Zellen durch Scherkr?fte platzender Blasen gesch?digt werden. Es wurden verschiedene Begasungsstrategien entwickelt, um eine ordnungsgem??e Sauerstoffversorgung zu gew?hrleisten und gleichzeitig Stress und Schaumbildung gering zu halten - insbesondere bei Bioreaktoren im Produktionsma?stab (> 250 l). Bei diesem Vorgehen kommt es zu einer Ansammlung von gel?stem CO₂, dem normalerweise durch Stripping des Mediums mit Stickstoff entgegengewirkt wird. Für das Stripping ben?tigt der Bioreaktor-Controller Online-CO₂-Informationen, weswegen zuverl?ssige Messtechnologien für gel?stes CO₂ gebraucht werden. Daher wurde ein neuartiges Messsystem evaluiert, das die Bestimmung der gel?stem pCO₂ Konzentration im Kulturmedium in Echtzeit in einem 10 l Scale-Down-Modellprozess erm?glicht. Aufgrund des kleinen Reaktors und damit des geringen Gesamtmedienvolumens und des geringen hydrostatischen Drucks w?ren nur geringe CO₂ Konzentrationen zu erwarten, dennoch sollte die Anwendbarkeit und Genauigkeit des Sensorsystems nachgewiesen werden.
Das System besteht aus drei Komponenten: (i) einem ? ”C-Flex-Schlauch mit integrierter Durchflusszelle und Temperatursensor, die bestrahlt geliefert werden und in einen Bypass eingebaut werden k?nnen, (ii) einem optischen pCO₂ Sensor, der am distalen Ende eines Sensorsticks befestigt ist, separat in einem Quetschbeutel mit physiologischer Kochsalzl?sung verpackt ist und der über einen Luer-Anschluss in der Laminar-Bank in die Durchflusszelle integriert werden kann, (iii) ein optisches pCO₂-Messger?t für pCO₂- und Temperaturmessung, die über einen PC gesteuert wird (4-20 mA Ausgangsmodul verfügbar, aber in dieser Studie nicht verwendet). Die separaten Komponenten erm?glichen eine sichere und einfache Installation unter laminarer Str?mung. Wenn der Bioreaktor-Aufbau fertig ist, k?nnen der optische CO₂-Sensor und der Temperatursensor an das CO₂-Messger?t angeschlossen werden. Dieses System zur pCO₂-?berwachung wurde in einem CHO Fed-Batch-Verfahren getestet und gegen Offline-Messungen referenziert.

CHO GS-Knockout-Zellen (Horizon^TM) wurden in standardisiertem S?ugerzellkulturmedium in einem 10 l Rührkessel-Glasbioreaktor mit einer anf?nglich lebensf?higen Zellkonzentration von 1,0 × 10⁶ Zellen/ml gezüchtet. Das Fed-Batch-Verfahren wurde mit Begasung bei Bedarf und einem Temperatursollwert von 35,5 °C vor und 32 °C nach der Temperaturverschiebung am Tag 6 der Kultivierung durchgeführt. Temperatur und pCO₂ wurden online mit einem von PreSens entwickelten Messaufbau überwacht. In einem Bypass wurde eine ? ”C-Flex-Baugruppe mit integrierter Durchflusszelle und Temperatursensor installiert. Der CO₂ Sensorstick und der in die C-Flex-Baugruppe eingesetzte Temperatursensor wurden zur Online-?berwachung an das CO₂-1 SMA Messger?t angeschlossen. Das Kulturmedium wurde mit einer peristaltischen Pumpe mit 60 ml/min durch den Bypass gepumpt. Die Zellzahl (Cedex HiRes, Roche CustomBiotech), der pH und der pCO₂ (Bioprofiler pHOx, Nova) wurden über t?gliche Offline-Messungen bestimmt.

Abbildung 3 zeigt die online und offline bestimmten Kulturparameter im CHO Fed-Batch-Prozess. Die maximale lebensf?hige Zellkonzentration von 2,61 × 10⁷ Zellen/ml wird am achten Tag erreicht. Die online im Bypass mit dem PreSens Messsystem gemessene Temperatur liegt ca. 2 °C unter den Temperatursollwerten von 35,5 °C vor und 32 °C nach der Temperaturverschiebung. Die Online-Messungen zeigen jedoch deutlich die Temperaturverschiebung am 6. Tag, die durchgeführt wird, um die Lebensf?higkeit und Produktivit?t der Zellen zu verl?ngern. Das Verfahren wurde bei pH 7 durchgeführt. Der pH-Wert f?llt w?hrend der ersten 5 Tage der Kultivierung aufgrund der Stoffwechselaktivit?t der Zellen leicht ab.
W?hrend der ersten fünf Tage der Kultivierung steigt der pCO₂-Gehalt im Kulturmedium langsam von 3 % auf 5 %. Die Einbrüche bei den Online-pCO₂-Messungen werden durch die t?glichen Substratzugaben verursacht, die das Kulturmedium verdünnen und den pCO₂-Spiegel verringern. Nach Erreichen der maximal lebensf?higen Zellkonzentration bleibt die pCO₂-Konzentration bei 4,2 ± 0,1 %. Die Grafik zeigt, dass online gemessene pCO₂-Werte gut mit den t?glichen Offline-pCO₂-Messungen übereinstimmen.

Die Evaluierung des neuen PreSens pCO₂-Messaufbaus für Bioreaktor-Byp?sse ergab, dass dieses System genaue Echtzeitdaten für die Kulturkontrolle liefert. Die C-Flex-Konnektivit?t dieses speziellen Loops mit optischer Messtechnologie erm?glicht die sichere Installation des Sensors in autoklavierten Tisch- oder Einweg-Bioreaktoren, sofern diese mit dem richtigen C-Flex-Schlauch-Gegenstück ausgestattet sind.

Danksagung
Das zu diesem Bericht führende Projekt wurde von der gemeinsamen Initiative Innovative Medicines Initiative 2 im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 777397 finanziert. Dieses gemeinsame Unterfangen erh?lt die Unterstützung des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europ?ischen Union und EFPIA.

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