Online Sauerstoffüberwachungssystem

Nicht-konventionelle Steroidfermentation in Mikrotiterplatten

Ein Schlüsselfaktor bei der Optimierung und Entwicklung von Bioprozessen ist die ?berwachung der Fermentation, um unter anderem Parameter wie Sauerstoff, pH-Wert und Kohlendioxid in Echtzeit zu quantifizieren. Die ?berwachung mittels SDR erlaubt es, den zeitlichen Verlauf der Fermentation zu verfolgen und Prozessparameter auf gewünschte Werte einzustellen. Die Online-?berwachung in gerührten Beh?ltern, insbesondere Fermentern, ist eine weit verbreitete Vorgehensweise, wurde jedoch aufgrund technischer Einschr?nkungen selten in geschüttelten Systemen angewendet.

Der SDR SensorDish? Reader (Abb. 1) erm?glicht die nicht-invasive Online-?berwachung von Sauerstoff und pH w?hrend Fermentationsprozessen in 24-Well Mikrotiterplatten. In der vorliegenden Arbeit wurde diese Vorrichtung getestet und verwendet, um den zeitlichen Verlauf einer mehrstufigen Biotransformation sowohl in w?ssrigen (Abb. 2) als auch in organisch-w?ssrigen Systemen mit zwei Flüssigphasen (Abb. 3) zu verfolgen. Als Modellsystem für Sitosterol-Seitenkettenspaltung zu Androstendion (AD) wurde Mycobacterium sp. NRRL B-3805 ausgew?hlt (Marques et al., 2007).

Material & Methoden

Mycobacterium sp. NRRL B-3805-Zellen wurden in 24-Well Mikrotitterplatten mit integrierten Sauerstoffsensoren (OxoDishes?) kultiviert und für einen Zeitraum von etwa 60 Stunden unter Schütteln mit 200 U/min bei 30 °C inkubiert. Das verwendete synthetische w?ssrige Kulturmedium wurde im Vorfeld definiert (Marques, et al., 2007). Um eine Verdunstung des Mediums zu verhindern, wurde AeraSeal Dichtungsband verwendet. Die Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium wurde w?hrend des gesamten Kulturzeitraums mit der SensorDish? Reader Software online überwacht. Der Sauerstoffverbrauch wurde mit dem Verbrauch der Kohlenstoffquelle und der Produktbildung, die offline durch HPLC gemessen wurden (Marques et al., 2007), unter Verwendung von Opfer-Wells verglichen. Hinsichtlich der Wahl des L?sungsmittels wurden die Zellen in Gegenwart einer zweiten Phase, bestehend aus mehreren organischen L?sungsmitteln, kultiviert. Das Wachstum wurde durch Sauerstoffverbrauch überwacht.

Das Sauerstoffverbrauchsprofil (Abb. 2) zeigt deutlich die unterschiedlichen Wachstumsphasen der Fermentation. Wir beobachteten eine Lag-Phase von etwa 15 Stunden, in der die Sauerstoff- und Substratmengen in etwa unver?ndert blieben. Nach dieser Zeit wurde neben der Produktbildung ein signifikanter Sauerstoff- und Kohlenstoffquellenverbrauch beobachtet. Schlie?lich gingen die Zellen in die station?re Phase über, was durch den Anstieg des pO₂ bei gleichzeitiger Ersch?pfung der Kohlenstoffquelle angezeigt wird. Die Wirkung der L?sungsmittel, die als Substrattr?ger für das Mykobakterien-Wachstum verwendet wurden, wurde für diese spezielle Biotransformation ebenfalls mit der SensorDish? Reader-Technologie untersucht (Abb. 3). L?sungsmittel wie Silikon, Dioctylphthalat (DOP) und Propylenglycol (PPG) wurden getestet und das Wachstum wurde mit dem in einem herk?mmlichen Medium (Standard) verglichen. Frühere Studien zeigten, dass DOP chemisch mit Mikrotiterplatten wechselwirken kann (Marques, et al., 2007). Mit dem OxoDish? ist ein ?hnliches Ph?nomen aufgetreten, jedoch blieb der Sensor zur Sauerstoffüberwachung unbeeinflusst. Wir konnten das best?tigen, indem wir die Schüttelbewegung abrupt stoppten und die Sensorreaktion beobachteten. Der Abfall der Sauerstoffwerte nach dem Stoppen und die anschlie?ende Wiederherstellung der Ausgangswerte zeigen den Ansprechwert. Diese Technik wurde auch verwendet, um die Reaktion des Sensors in Gegenwart von Silikon zu best?tigen. In beiden L?sungsmitteln gab es kein Zellwachstum. Wir konnten best?tigen, dass Propylenglycol ein geeignetes L?sungsmittel ist (Stefanov et al., 2006), wie das identische Wachstumsprofil zeigte, das für Zellen ohne organische L?sungsmittel aufgezeichnet worden war.

?berwachung des zeitlichen Ablaufs der Fermentation

Beide Ergebnisse zeigen die Stabilit?t und Flexibilit?t der SensorDish? Reader-Technologie als geeignetes Werkzeug zur ?berwachung des zeitlichen Verlaufs der Fermentation, auch in nicht-konventionellen Medien. Die erhaltenen Daten stimmen eng mit denen überein, die in herk?mmlichen Vorrichtungen gesammelt wurden, n?mlich gerührten Fermentern und gro?en Schüttelkolben (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse tragen dazu bei, dass Mikrotiterplatten als Grundlage für repr?sentative Screening-Systeme benutzt werden, und somit die Reproduzierbarkeit über alle Ma?st?be hinweg sicherstellt ist. Diese F?higkeit zeigt die Eignung dieser Plattform für die Durchführung biokatalytischer Studien in komplexen Biotransformationssystemen, z. B.  für die Prozessentwicklung und -verbesserung. Da der SensorDish? Reader eine hohe Anzahl paralleler Experimente zul?sst, ist es m?glich, schneller das gewünschte Ergebnis zu erzielen, wodurch nicht nur die damit verbundenen Kosten, sondern auch der Arbeitsaufwand reduziert werden.

Referenzen
Marques, M. P. C., de Carvalho, C. C. C. R., Claudino, M. J. C., Cabral, J. M. S., Fernandes, P. (2007) On the feasibility of the microscale approach for a multi-step biotransformation: sitosterol side-chain cleavage. J. Chem. Technol. Biotechnol., 82, 856 - 863.