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Online-?berwachung von Glukose, pH und DO in Schüttelkolbenkultur
Neuartiger Glukosesensor in Kombination mit dem SFR Shake Flask Reader
I. Bauer1, G. T. John2, S. Spichiger3, und U. E. Spichiger-Keller3
1Züricher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, School of Life Sciences and Facility Management, Fachstelle Bioverfahrens- und Zellkulturtechnik, Waedenswil, Schweiz
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
3C-CIT AG, Waedenswil, Schweiz
Ein neuer Single-Use Glukosesensor in Kombination mit chemisch-optischen Sauerstoff- und pH-Sensoren wurde zur Online-?berwachung von CHO-Zellkulturen in Schüttelkolben eingesetzt. W?hrend des gesamten Prozesses wurden auch Offline-Messungen durchgeführt. Es zeigte sich, dass der optimale Erntezeitpunkt für die Kultur sehr viel früher war, als bisher aus Offline-Werten abgeleitet wurde. Diese Studie zeigte einen Unterschied in Offline- und Online-Werten, verursacht durch Zeitunterschied und Umweltbedingungen.
Die FDA ermutigt Hersteller, Prozessanalysetools als effektive und innovative Ans?tze bei der Entwicklung und Qualit?tssicherung zu verwenden. Die hier beschriebenen Sensoren erm?glichen eine verbesserte ?berwachung kritischer Kulturparameter w?hrend des Prozesses. Neuartige Single-Use Glukosesensoren (CITSens Bio, C-CIT, W?denswil) nutzen einen enzymatischen Oxidationsprozess und einen direkten Elektronentransfer von Glukose zur Elektrode durch einen chemischen Schaltungsprozess. W?hrend andere enzymatische Glukosesensoren Querempfindlichkeit gegenüber Sauerstoff zeigen, ist dies bei dem neuen Sensortyp nicht der Fall. Zur Trennung vom Kultivierungsmedium bedeckt eine Dialysemembran den Sensorkopf. Diese Sensoren sind in den Belüftungskappen der Schüttelkolben integriert (Abb. 1). Für die hier beschriebenen Experimente wurden die Glukosesensoren zusammen mit SFS Sensorkolben von PreSens mit chemisch-optischen Sauerstoff- und pH-Sensoren verwendet. Die optischen Sensoren werden mit dem SFR Shake Flask Reader, der im Inkubator installiert ist, nicht-invasiv durch den Boden der Kolben ausgelesen. Beide Sensorsysteme erm?glichen eine drahtlose Datenübertragung zu einem PC, so dass Online-Daten ohne St?rungen aufgezeichnet werden k?nnen, da ein ?ffnen der Inkubatortür und das Entnehmen der Schüttelkolben zur Probennahme nicht notwendig ist.
Material & Methoden
Drei 125 ml Schüttelkolben mit integrierten pO2- und pH-Sensoren wurden in diesen Experimenten verwendet. Jeder war mit einem in der Belüftungskappe des Kolbens integrierten Glukosesensor von C-CIT ausgestattet. Zellkulturmedium (ChoMaster? HP-1, Cell Culture Technologies LLC) wurde mit CHO-Zellen inokuliert und in die Kolben gefüllt. Die anf?ngliche lebensf?hige Zelldichte betrug 0,64 × 105 Zellen ml-1 bei 97 % Lebensf?higkeit. Zu Beginn betrug die Glucosekonzentration 3,59 g l-1, gemessen mit einem enzymatischen Offline-Analysator (BioProfile?, Nova Biomedical Corporation) und 4,05 g l-1, gemessen mit HPLC. Aus praktischen Gründen wurden die Glukosesensoren in einer einfachen Ein-Punkt-Kalibrierung entsprechend dem Wert des enzymatischen Analysators bei 3,6 g l-1 kalibriert. W?hrend des gesamten Experiments wurden die Proben auch offline analysiert. Für die ersten 4 Tage wurden die Zellen bei 37 °C inkubiert, um Zellmasse zu erzeugen. Nach einem Medienwechsel zum Produktionsmedium am 4. Tag wurde die Temperatur auf 31 °C reduziert, um die Proteinproduktion für die n?chsten 6 Tage zu induzieren.
Online- gegen Offline-Analysedaten
Die Ausgangs-Glucosekonzentration, gemessen mittels HPLC (4,05 g l-1) und enzymatischem Analysator (3,59 g l-1), zeigte eine Differenz von 12,5 %. Da die Glukosesensoren gem?? den Werten des enzymatischen Analysators kalibriert wurden, zeigten die Inline-Glukosesensoren Anfangswerte von 3,6 g l-1. Einer der Glukosesensoren zeigte nach 4 Tagen etwas h?here Werte, aber alle Sensoren zeigten den gleichen Glukoseverbrauch (Abb. 2). Der mit den Offline-Methoden gemessene Unterschied in den anf?nglichen Glukosewerten von 0,5 g zeigt, wie schwierig es ist, zuverl?ssige Glukosemessungen durchzuführen. Abh?ngig von der verwendeten Methode, Stichproben und Zeitdifferenzen bis zur Analyse k?nnen die Werte verf?lscht werden. Aus diesem Grund ist die Offline-Glukosemessung m?glicherweise nicht zur Prozesskontrolle geeignet. Das gleiche konnte für die pH-Messung beobachtet werden. Die Offline-Messung zeigte einen anf?nglichen pH-Wert von 8,1, w?hrend die Online-Werte, die mit den chemischen optischen Sensoren am Boden jedes Kolbens gemessen wurden, 7,2 bis 7,3 betrugen. Dieser Unterschied resultiert aus unterschiedlichen Umgebungsbedingungen w?hrend der Messung. Die Inkubatoratmosph?re ist auf eine CO2-Konzentration von 5 % v/v eingestellt. CO2 muss in den Medien ins Gleichgewicht kommen, und der endgültige pH-Wert wird erst erreicht, nachdem die Zellkulturmedien einige Minuten im Brutschrank aufbewahrt werden. Aus diesem Grund unterscheiden sich Offline-Werte, die in einer Laborumgebung genommen werden, von Online-Werten. Die Online-Messung spiegelt immer die reale Situation wider. In den ersten vier Tagen zeigten sich die drei typischen Wachstumsphasen in den Daten aller drei Sensoren (Glukose, pH und pO2, Abb. 3). W?hrend der ersten 10 Stunden gab es eine deutliche Lag-Phase, in der sich die Steigung aller drei Sensoren von der Steigung w?hrend der folgenden exponentiellen Wachstumsphase unterschied. In den n?chsten 36 - 42 Stunden zeigte der Online - Sauerstoffsensor die erh?hte Sauerstoffaufnahme w?hrend des exponentiellen Wachstums, wonach die Werte w?hrend der Produktionsphase wieder anstiegen, da der Sauerstofftransfer in die Medien den Sauerstoffverbrauch der Zellen überstieg (Abb. 4). Aus Erfahrung und externer Probenanalyse wurde angenommen, dass die Zellkultur mindestens 72 Stunden ben?tigt, um die maximale Zelldichte mit einem hohen Anteil an lebenden Zellen zu erreichen. In diesem Test zeigten die Online-Sensoren den optimalen Erntezeitpunkt nach ca. 45 Stunden an. Die verwendeten Medien ver?nderten sich leicht, was zu einem schnelleren Zellwachstum führte. Durch einen zeitgesteuerten Prozess oder manuelle Stichproben w?re diese ?nderungen m?glicherweise nie entdeckt und viel Produktionszeit verschwendet worden.
Zusammenfassung
Der Einsatz von Online-Glukosesensoren in Kombination mit chemisch-optischen pH- und pO2-Sensoren erm?glichte die kontinuierliche ?berwachung dieser wichtigen Prozessparameter in Schüttelkolbenkulturen. Die Ergebnisse dieser Tests zeigen die Wirksamkeit der Online-?berwachungsger?te zur Kontrolle der Prozessqualit?t. Im Vergleich zu Offline-Methoden bieten diese Sensoren viele Vorteile, da keine manuelle Probenahme erforderlich ist, das Kontaminationsrisiko reduziert wird und keine Reagenzienkosten anfallen wie bei Batch-Analysatoren. ?nderungen im Prozess k?nnen sofort erkannt werden. Die Online-DO-Messung und die Glukosemessung zeigen pr?zise Stoffwechselver?nderungen in der Kultur. Mit den integrierten Sensoren k?nnen Messungen unter realen Bedingungen durchgeführt werden. Die hier getesteten ?berwachungsger?te wurden in Schüttelkolben appliziert, k?nnten aber auch für gr??ere Volumina wie Single-Use Bioreaktoren (S.U.B.) eingesetzt werden.