Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate in geschlossenen Mikrorespiratoren

Bei der Anwendung auf Samen, wie in diesem Anwendungsbericht beispielhaft dargestellt, verdeutlicht die Sauerstoffdynamik den metabolischen Umschaltvorgang, der den ?bergang von der Ruhephase zum aktiven Wachstum kennzeichnet. Dieses Verfahren erfasst die Imbibitionsverz?gerung der Samen, den Beginn der Atmungsaktivierung und den anhaltenden Sauerstoffverbrauch w?hrend der Keimung – Kennzahlen, die die Keimkraft quantifizieren, frühe Sch?den erkennen und Priming- oder Stressbehandlungen auf skalierbare und reproduzierbare Weise durch die Bewertung der jeweiligen Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) bewerten.

Einzelne Brokkoli- und Wei?kohlsamen dienen in dieser Atmungsstudie als Proben. In jede Vertiefung einer 96-Well PhoxyPlate 96 O wurden 100 ?l einer 2 %-igen (w/v) Phytagel-L?sung bei 80 °C gegeben. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur bildete das Phytagel eine stabile Gelschicht. Nach dem Abkühlen des Gels wurde in jede Vertiefung ein einzelner Samen auf das Phytagel gelegt. Die Platte wurde vertikal in zwei H?lften für die beiden Saatgutarten geteilt. Eine Reihe diente als Blindkontrolle (Abb. 2). Das Hydrogel erfüllt in dieser Studie mehrere Zwecke: Es stellt ein definiertes Wasserreservoir bereit, das zur Aktivierung der Samen ben?tigt wird, h?lt die Luftfeuchtigkeit in den Kammern konstant und verhindert den direkten Kontakt des Samens mit dem Sensormaterial am Boden der Vertiefung, wodurch m?gliche starke lokale Schwankungen am Sensor vermieden werden, die zu einer Messverzerrung führen würden. Nach dem Einbringen der Samen in die Vertiefungen wurde die Platte mit einer Aluminium-Versiegelungsfolie für Wellplatten versiegelt, um das Eindringen von Umgebungsluft zu verhindern. Die Proben wurden in einen temperaturgeregelten Schrank bei 18 °C und 1 atm Luftdruck gestellt und über einen Zeitraum von insgesamt ~ 6 Tagen alle 5 Minuten überwacht.

Samen durchlaufen eine anf?ngliche Imbibitionsphase (Tag 0 - 2), in der sie Wasser aufnehmen und aktiviert werden. Samen, die ihren Keimungsprozess beginnen (Tag 2 - 3), aktivieren damit ihren Stoffwechsel, was aufgrund der Atmung zu einem st?rkeren Sauerstoffverbrauch führt. Die O₂-Werte in den geschlossenen Atmungskammern sinken mit der Zeit. Bei 5 von 42 untersuchten Wei?kohlsamen (in den Vertiefungen A5, E4, E5, F3, F5) wurde nach der Imbibitionsphase kein Sauerstoffabfall festgestellt, was ein eindeutiges Anzeichen für eine fehlgeschlagene Keimung ist (siehe Abb. 3). Die Nichtkeimrate der untersuchten Wei?kohlsamen betrug 88 %, verglichen mit einer Keimrate von 100 % bei den untersuchten Brokkolisamenproben.

Diese Studie konzentriert sich auf die prim?re Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) w?hrend der Keimphase, in der im Vergleich zur Imbibitionsphase eine h?here Stoffwechselaktivit?t zu beobachten ist. Aus jeder parallelen Atmungsmessung l?sst sich die steilste O?-?nderung in % a.s. pro Stunde bestimmen. Daher wird die maximale OCR pro Vertiefung (Abb. 4) aus dem Sauerstoffabfall zwischen zwei einzelnen Messpunkten im Zeitintervall von 4 Stunden berechnet. Das gew?hlte Zeitintervall kann für Proben mit h?herer oder niedrigerer Atmungsaktivit?t angepasst werden. Für die relativ langsame Atmung kleiner Samen ist ein 4-Stunden-Intervall eine gute Grundlage.

Der pO?-Wert in % a.s. kann mittels eines Umrechnungsfaktors in O?-Mengen in Mol oder nmol umgerechnet werden, wobei es sich um eine auf der Stoffmenge basierende Einheit handelt. Bei einem Einphasensystem ist dies einfach, indem entweder das ideale Gasgesetz (gasf?rmiges System) oder das Henrysche Gesetz (w?ssriges System) angewendet wird. Im gezeigten Beispiel enthielt jede Vertiefung 100 ?l Phytagel-Hydrogel und 260 ?l Luft im Kopfraum und stellt somit ein Zweiphasensystem dar. Unter der Annahme eines Gleichgewichts zwischen den beiden Phasen l?sst sich die Gesamtsauerstoffmenge bei 18 °C und 1 atm Druck aus dem idealen Gasgesetz für die Luftphase (1 % a.s. pO? = 22,3 nmol) + dem gel?sten Sauerstoff in 100 ?l w?ssriger Phase (1 % a.s. pO? = 0,254 nmol) nach dem Henry-Gesetz berechnen. Der Gesamtumrechnungsfaktor für das Zweiphasensystem wurde mit 1 % a.s. pO? = 22,6 nmol O? berechnet. Der durchschnittliche OCR für die beiden untersuchten Probentypen betr?gt 49,8 ± 15 nmol/Stunde pro Wei?kohlsamen (ohne die 5 nicht keimenden Proben) und 69,6 ± 20 nmol/Stunde pro Brokkolisamen.

Das hier vorgestellte 96-Well-Format mit geschlossener Kammer, bestehend aus dem PhoxyCube und den mit Sensoren ausgestatteten Well-Platten PhoxyPlate 96 O, erm?glicht echte parallele, zeitaufgel?ste Atmungsmessungen – wobei jede Vertiefung als eigenst?ndiges Respirometer fungiert –, w?hrend gleichzeitig der Gasaustausch mit der Umgebung und Kreuzkontaminationen verhindert werden. Diese Konfiguration liefert skalierbare, quantitative Messwerte (z. B. maximaler O?-Abfall, umgerechnet in nmol (O?) pro Stunde) und unterstützt anpassbare Probenahmeintervalle, um unterschiedlichen Atmungsraten gerecht zu werden. ?ber den Einsatz bei Samen hinaus kann der Ansatz mit verschiedenen kleinen biologischen Proben oder Behandlungen für die Hochdurchsatz-Ph?notypisierung, Dosis-Wirkungs-Tests und zeitliche kinetische Studien genutzt werden.