pH-Regulierung für einen Leberzellbioreaktor

Protoypenentwicklung mit einer chemisch-optischen pH Durchflusszelle

Ein wichtiger Aspekt effizienter Leberzellbioreaktoren ist die automatisierte Regulierung von physio-chemischen Kulturparametern. Die vorliegende Studie beschreibt die Entwicklung der ersten nicht-invasiven pH-Regulationsvorrichtung für einen Perfusionsbioreaktor. Die hohe Leistungsf?higkeit des Systems basiert auf einer chemisch-optischen Durchflusszelle zur pH-Detektion und deren Kombination mit pr?zisen Gas-Massendurchflussreglern. Der neue Controller erm?glicht eine langzeitstabile und kontaminationsfreie Online-pH-Regulierung in komplexen Bioreaktorsystemen - ein wichtiger technischer Beitrag für zukünftige klinische Anwendungen.

Die Transplantationsmedizin erwartet gro?e Fortschritte von Leberzellbioreaktoren (Abb. 1) für die klinische Behandlung von Patienten mit akutem Leberversagen. In einem Notfall sollten Leberzellbioreaktoren die Leberfunktion des Patienten unterstützen. Auf diese Weise k?nnte die Wartezeit vor der Transplantation einer geeigneten Spenderleber überbrückt werden. Die Leber beteiligt sich an wichtigen physiologischen Aufgaben wie Proteinbiosynthese, Zuckerstoffwechsel, Lipogenese, Ausscheidung von Gallens?uren oder Abbau- und Entgiftungsfunktionen. Für eine erfolgreiche in vitro Kultur von metabolisch aktiven Leberzellen sind spezielle Kultursysteme erforderlich. Ideale Wachstumsbedingungen hinsichtlich N?hrstoff- und Sauerstoffversorgung sowie physikalisch-chemische Kulturparameter müssen gegeben sein. Innerhalb des Bioreaktors fungiert ein dichtes Kapillarnetzwerk sowohl als Wachstumssubstrat für Zellen als auch als Tr?gersystem für N?hrstoffe. Mit solchen Bioreaktorsystemen k?nnen Leberzellen bereits in stabiler Langzeitkultur gehalten werden. Zur weiteren Verbesserung seiner Leistungsf?higkeit und Zuverl?ssigkeit wurde nun eine automatisierte und transportable pH-Regulierungstechnik entwickelt. Ein besonderes Merkmal der implementierten Steuerschaltung ist ein nicht-invasives Messger?t zur online pH-Detektion. Basierend auf einer raffinierten optosensorischen Messtechnik erm?glicht der Durchfluss-pH-Detektor von PreSens eine kontaminationsfreie pH-Regulierung im Bioreaktor.

Der optimale pH-Wert für die Leberzellkultur liegt zwischen pH 7,3 - 7,45. Um einen dauerhaft stabilen pH-Wert im Bioreaktor zu erreichen, muss die Menge an zugesetztem CO₂ kontinuierlich an den aktuellen pH-Wert angepasst werden. Der zugrundeliegende Regelkreis (Abb. 2) besteht neben der pH-Durchflusszelle aus einem Aktor für das Gasgemisch sowie der Berechnungseinheit - dem eigentlichen Controller. Da eine Leberzellkultur nur minimale pH-Abweichungen tolerieren kann, wurde ein PI (Proportional-Integral)-Controller gew?hlt. Dieser Reglertyp kann exakt an die spezifischen Anforderungen des Bioreaktorsystems angepasst werden. Für die Zellen im Bioreaktor ist eine PI-Regelung besser geeignet als eine Zweipunktregelung, da keine dauerhaften Verschiebungen des kontrollierten Zustands stattfinden. Der pH-Wert des Zellkulturmediums wird nicht-invasiv vom Durchflusssensor überwacht und an den Controller übermittelt. Der implementierte PI-Steuerungsalgorithmus berechnet dann die manipulierte Variable. Der Controller sendet diese Daten an die Massenstromventile, die ein konstantes Gasgemisch erzeugen, das durch die Kapillaren des Bioreaktors flie?t.

Die Eigenschaften des neuen PI-Regelkreises k?nnen durch induzierte St?rungen nachgewiesen werden. Eine hohe metabolische Zellaktivit?t innerhalb des Bioreaktors wird durch Zugabe von Zitronens?ure (12 bzw. 25 mg/ml) zum Kulturmedium simuliert. Die überwachten pH-Werte und die entsprechende Kompensation durch CO₂ zeigen folgende Eigenschaften des Regelkreises (Abb. 3): Nach anf?nglicher sprunghafter pH-?nderung von station?rem pH 7,4 auf pH 7,2 (Versuch 1) vergehen etwa 41 Minuten, bis wieder der Sollwert erreicht ist. Es dauert ca. 2h 45 min bis zur vollst?ndigen Stabilisierung. Das ?berschwingen liegt in einem Bereich von 0,03 pH-Einheiten. Im 2. Versuch nahm der pH-Wert ebenfalls sprunghaft von pH 7,4 auf pH 6,92 ab. Der Sollwert wurde nach 26 Minuten wieder erreicht. Das maximale ?berschwingen betrug 0,04 pH-Einheiten. Komplette Systemstabilisierung erfolgte nach 2 h 50 min. Obwohl in der vorliegenden Studie ein fester Sollwert-Regelkreis realisiert wurde, ist die Regelleistung auch bei anderen pH-Sollwerten bemerkenswert. Abbildung 4 zeigt die Eigenschaften der Regelleistung für zwei verschiedene Sollwertverschiebungen: pH 7,8 zu 7,4 (a) und pH 7,4 zu 7,5 (b). Aus den Daten k?nnen wichtige Qualit?tsmerkmale der Ansprechzeit wie Kontrollabweichung, Anstiegs- und ?bergangszeit sowie das vorübergehende ?berschwingen abgeleitet werden. Im ersten Fall lag das vorübergehende ?berschwingen bei 15 %, mit einer Anstiegszeit von 1.600 Sekunden und einer ?bergangszeit von 6.400 Sekunden. Die Kontrollvariable erreicht den pH-Wert von 7,4 und h?lt ihn auch konstant, besser als mit einem zweistufigen Steuerger?t (Details in Originalfassung). Wie bei den ersten Sollwertverschiebungen erreicht der pH-Wert den vorgeschlagenen zweiten Wert von pH 7,5 und bleibt konstant. Das vorübergehende ?berschwingen betr?gt etwa 20 %, die Anstiegs- und ?bergangszeit liegt bei 1.800 Sekunden bzw. 4.800 Sekunden. Die Studie zeigt, dass auch andere pH-Werte als die vorher festgelegten pH-Werte von pH 7,3 - 7,45 gew?hlt werden k?nnen.

Hervorragende Perspektiven

Dieser Prototyp für nicht-invasiven pH-Regulierung in Bioreaktoren ist ein wichtiger Beitrag zur weiteren Optimierung der methodischen Grundlagen für klinische Anwendungen bei Lebererkrankungen und Zelltransplantationen. Die integrierte opto-sensorische pH-Messtechnik von PreSens meistert in besonderer Weise die hohen Anforderungen an Messgenauigkeit und kontaminationsfreie Langzeitstabilit?t. Ein klinischer Test des pH-gesteuerten Perfusionsbioreaktors rückt n?her.

Applikationsbericht nach
der Diplomarbeit von Marco Decker, Fachhochschule für Technik und Wirtschaft Berlin (FHTW), Berlin, Deutschland (2007).