Qualit?tsbewertung von prim?ren humanen Keratinozyten-Kulturen

Eine spontan immortalisierte menschliche Keratinozyten-Zellinie (HaCaT-Zellen) und prim?re menschliche Keratinozyten wurden für diese Experimente verwendet. Beide Zelltypen haben eine kritische minimale Zelldichte für die Inokulation. Wenn dieser minimale Wert der Zelldichte nicht erreicht wird, verlangsamt sich das Zellwachstum oder es findet überhaupt kein Wachstum statt. Beide Zelltypen wurden parallel mit vier verschiedenen Startzelldichten von 2 × 10³, 1,9 × 10⁴, 6,7 × 10⁴ und 3,8 × 10⁵ Zellen / Well kultiviert. Referenzmessungen wurden in zellfreien Proben durchgeführt. Als Kultivierungsgef??e verwendeten wir 24-Well Oxo- und HydroDishes? von PreSens die mit dem SDR SensorDish? Reader ausgelesen wurden. Die Oberfl?che der 24-Well Platten wurde für die Experimente mit Kollagen beschichtet, und für jede Zelldichte ein Well online mit dem SDR analysiert. Die Kulturdauer betrug 12 Tage. Die Kultivierung fand unter Standardbedingungen in 5 % CO₂ Atmosph?re mit definiertem Serum-freiem Keratinozyten-Medium (Gibco Defined Keratinocyte-SFM) statt. Das Medium wurde jeden Tag durch ?quilibriertes, frisches Medium ersetzt.

Messungen in Kulturen epidermaler HaCaT-Zellen wurden als Referenz für prim?re Keratinozyten verwendet. Die Sensitivit?t des SDR-Systems erlaubte es, auch kleinste Ver?nderungen in den kaum metabolisch aktiven HaCaT-Zellen zu detektieren - selbst bei Ausgangszelldichten von nur 1,9 x 10⁴ Zellen/Well (Abb. 2). Messungen in geringere Anfangszelldichten zeigten keinen Unterschied zu Werten, die in den zellfreien Kontroll-Wells ermittelt wurden. Eine kontinuierlich ansteigende Sauerstoffverbrauchsrate konnte für die mit 6,7 x 10⁴ Zellen/Well angeimpfte Zellkultur gemessen werden. An Tag 6 erreichte diese Kultur die gleichen DO-Werte wie die Kultur, die mit der h?chsten Zelldichte angesetzt worden war. Daher ist die ideale Ausgangszelldichte für HaCaT-Kultur 6,7 × 10⁴ Zellen/Well. Die schnelle Abnahme der DO-Konzentration auf Minimalwerte, innerhalb weniger Stunden nach dem Medienwechsel, l?sst auf eine hohe Proliferation und metabolische Aktivit?t schlie?en. Die gleichzeitig aufgezeichneten pH-Werte lieferten ?hnliche Ergebnisse (Abb. 2). Die Abnahme der pH-Werte korrelierte eng mit der jeweiligen Ausgangszelldichte. Die pH-Werte nahmen über die gesamte Kulturdauer von 12 Tagen kontinuierlich ab. Kulturen mit der h?chsten Ausgangszelldichte zeigten nach 12 Tagen Kultivierung einen pH-Wert von 6,8. Im Gegensatz zur DO-Kinetik konnten Unterschiede, die auf der Ausgangszelldichte beruhten, gegen Ende der Kultivierungsperiode noch deutlich nachgewiesen werden. Die Zellproliferation wurde nach 3 und 12 Tagen der Kultivierung analysiert (Abb. 1A) und korrelierte mit den SDR-Messungen.

Der Sauerstoffverbrauch in prim?ren Keratinozyten (Abb. 3) war zu Beginn der Kultivierung ?hnlich dem von HaCaT-Zellen, zeigte jedoch mit fortlaufender Kultivierungsdauer deutliche Unterschiede. Die Probe mit der niedrigeren Ausgangszelldichte von 2 x 10³ Zellen/Well zeigte im Gegensatz zu den HaCaT-Zellen ab dem 7. Tag signifikante metabolische Aktivit?t. Prim?re Keratinozyten k?nnen niedrigere Anfangszelldichten als die HaCaT-Zellen tolerieren. Kulturen mit hohen Ausgangszelldichten erreichten nach nur 3 Tagen ein Minimum an gel?stem Sauerstoff (DO) von 22 %. Nach einem anf?nglichen Minimum von 10 % konnte am 1. Tag ein Aufw?rtstrend festgestellt werden. Im Unterschied zur HaCaT-Zellkultur setzte sich dieser Anstieg nach dem 5. Tag fort. Die DO-Werte stabilisierten sich nach jedem Medienwechsel auf einem h?heren Niveau. Gegen Ende der Kultivierungsdauer erreichte das DO-Niveau einen Wert von 70 % Lufts?ttigung. Andere Zellkonzentrationen zeigten die gleiche Tendenz mit einem 3-t?gigen Aufschub. Dies ist ein signifikanter Unterschied zu den gemessenen Werten in HaCaT-Zellkulturen, was den Schluss zul?sst, dass prim?re Keratinozyten ihre metabolische Aktivit?t allm?hlich reduzieren. Die merkliche Abnahme des Sauerstoffverbrauchs steht jedoch nicht in Zusammenhang mit einer Reduktion der lebensf?higen Zellzahlen (Abb. 1 B). Prim?re Keratinozyten zeigen im Vergleich zu den HaCaT-Zellen eine deutliche Kontaktinhibierung. Nach der Bildung einer Monoschicht h?ren die Zellen auf sich zu vermehren und der Stoffwechsel wird reduziert. Ein weiterer Grund k?nnen die durch hohe Zelldichten bedingte limitierenden Kulturbedingungen sein, auf die prim?re Keratinozyten empfindlicher reagieren als HaCaT-Zellen. Die pH-Kinetik (Abb. 3) für verschiedene Inokulationsgr??en zeigte die gleiche Tendenz wie die DO-Kinetik. In allen Kulturen nahmen die pH-Werte nach jeder Medien?nderung ab, jedoch reduzierte sich diese Abnahme ab dem 8. Tag. Selbst in der Kultur mit der niedrigsten Ausgangszelldichte konnte nach dem 7. Tag eine pH-Wert-Abnahme festgestellt werden, die bis zum Ende der Kultivierungszeit gr??er wurde. Diese Effekte hingen mit der Zellzahl und der Aktivit?t der prim?ren Keratinozyten zusammen und waren gegen Ende der Kultivierungsdauer am offensichtlichsten. Auch in diesem Fall betrug die ideale Ausgangszelldichte 6,7 x 10⁴ Zellen/Well.

Ein genauer Einblick in die Stoffwechselbedingungen innerhalb der Kulturgef??e erm?glicht neue und vielversprechende Perspektiven bei der Optimierung von Zellkulturprozessen. Die aufgezeichnete Kinetik zeigt, dass das SDR-System ideal zur ?berwachung sensitiver Keratinozytenkulturen geeignet ist. Bereits bei niedrigen Anfangszelldichten lassen sich DO- und pH-Kinetik eindeutig bestimmen. Mit diesen Grafiken k?nnen detaillierte Aussagen zur Kulturentwicklung abgeleitet werden. Auf diese Weise lassen sich entsprechend der Prozessziele definierte Kultivierungszeiten festlegen, in denen Kulturen optimale physiologische Bedingungen aufweisen, um zum Beispiel für die weitere Verwendung in der Transplantation oder für pharmazeutische Screening-Tests eingesetzt zu werden. Zukünftige Hochskalierungsprozesse lassen sich auf den mit dem SDR im 24-Well-Format gesammelten Ergebnissen aufbauen.