Verbesserung der Kulturbedingungen von Antik?rper-produzierender Hefe

Wir haben erfolgreich Saccharomyces cerevisiae St?mme entwickelt, die in der Lage sind, Antik?rper in voller L?nge (IgG) zu produzieren und diese mit menschlichen N-Glycanen zu glykosylieren [1, 2]. Gegenw?rtig liegt die IgG-Produktivit?t dieser gentechnisch ver?nderten Hefest?mme hinter anderen etablierten zellbasierten Produktionssystemen, wie CHO-Zellen, zurück und die Produktionstiter sind weit davon entfernt, kommerziell konkurrenzf?hig zu sein. Um die Produktivit?t zu verbessern, screenen wir regelm??ig verschiedene Arten von Deletionsst?mmen oder DNA-Bibliotheken zur Identifizierung genetischer Determinanten, die die IgG-Produktivit?t verbessern [3, 4]. Diese Bibliotheken k?nnen begrenzte S?tze von Kandidatengenen umfassen, die auf einen spezifischen zellul?ren Prozess abzielen, zum Beispiel Proteinfaltung, oder genomweite Deletionsbibliotheken. Die Anzahl der getesteten St?mme kann mehrere hundert umfassen. In unserem Standard-Screening-Setup unter Verwendung von 96er oder 24er Deep Well-Platten testen wir nur die IgG-Titer und die optischen Zelldichten nach 24 Stunden Wachstum. Um den Screening-Prozess weiter zu verbessern, w?re es wünschenswert, mehr Einblicke in die zellul?re Physiologie und die Kulturbedingungen zu erhalten. Insbesondere die pH-Entwicklung ist von gro?em Interesse, da aus früheren Experimenten bekannt ist, da? das sekretierte IgG bei neutralem pH-Wert am stabilsten ist, w?hrend Hefe vorzugsweise bei saurem pH-Wert w?chst. Eine weitere Komplikation besteht darin, dass die am h?ufigsten verwendeten Hefemedien typischerweise Hefe-Stickstoff-Basis (YNB) enthalten, die die Stickstoffquelle, Salze, Spurenelemente und Vitamine enth?lt, aber nur leicht gepuffert ist. Daher kann der Kultur-pH w?hrend der Kultivierungszeit ziemlich stark abfallen. Desshalb haben wir getestet, ob eine erh?hte Pufferkapazit?t der Medien die IgG-Produktion von S. cerevisiae beeinflusst.

W?hrend des Batch-Wachstums von S. cerevisiae in synthetischen Medien kann der pH-Wert aufgrund der geringen Pufferkapazit?t der Medien innerhalb von 24 Stunden bis auf pH 4 abfallen. Unter diesen sauren Bedingungen kann sich die Stabilit?t von Antik?rpern stark reduzieren, wodurch es vermehrt zu proteolytischem Abbau der sezernierten Moleküle kommt, was letztlich dazu führt, dass die Menge an produzierten Antik?rpern untersch?tzt wird. Um weitere Einblicke in unseren derzeit angewandten Screening-Prozess zu erhalten, haben wir Deep Well Oxo- und HydroDishes? verwendet. Bei der Kultivierung der Antik?rper-produzierenden Hefe in den synthetischen Medien fiel der anf?ngliche pH-Wert von etwa 5,7 bis 5,8 innerhalb der ersten fünf Stunden auf einen Wert unter 5. Die Antik?rpertiter nach 24 Stunden waren sehr gering und zus?tzliche Experimente zeigten, dass die h?chsten Antik?rpertiter bereits nach 12 bis 16 Stunden erreicht waren. Danach war ein rascher Abfall des Antik?rpertiters zu beobachten. Daher untersuchten wir, ob man durch die Zugabe von Puffersubstanzen dieses Problem umgehen k?nnte. Wir haben YEK18 in synthetischen Medien wachsen lassen, die mit steigenden Mengen an Phosphatpuffer (0 bis 50 mM) erg?nzt wurden. Vorkulturen wurden über Nacht gezüchtet, und drei Replikatkulturen wurden mit einer Anfangs-OD₆₀₀ von 0,2 in die Wells der Deep Well HydroDishes? inokuliert, die zuf?llig positioniert waren. Die Deep Well-Platten wurden 6 Stunden inkubiert, und die Antik?rperproduktion mit 0,5 % Galactose induziert. Die Kulturen wurden für weitere 18 Stunden inkubiert. Die pH-Werte wurden alle 10 Minuten aufgezeichnet und die resultierenden pH-Profile sind in Abb. 3 gezeigt. Verglichen mit dem Stamm-Wachstum in den synthetischen Standardmedien, hielt die Zugabe von steigenden Konzentrationen an Puffersubstanz den pH stabiler; aber immer noch fielen die pH-Werte selbst von mit 50 mM Phosphatpuffer gepufferten Kulturen auf Werte nahe 5. Die endgültigen Zelldichten nach 24 Stunden Wachstum lie?en erkennen, dass der Phosphatpuffer negative Auswirkungen auf das Wachstum hatte. Die endgültigen OD₆₀₀-Werte fielen um etwa 30 % von 8,61 in den synthetischen Standardmedien auf 6,22 in den mit 50 mM Phosphatpuffer gepufferten Medien (Abb. 3B). Im Gegensatz dazu ?nderten sich die endgültigen IgG-Titer in den Kulturen dramatisch, und bei Zugabe von Phosphatpuffer wurde eine mehr als fünffache Zunahme der Antik?rperendkonzentration beobachtet (Abb. 3C). Die Unterschiede der endgültigen IgG-Titer bei Kulturen mit erh?hter Pufferkapazit?t waren gering. Insgesamt erh?hte die Zugabe von Puffersubstanz die endgültigen IgG-Titer, obwohl, basierend auf den gemessenen pH-Profilen, der Effekt nicht nur auf einen stabileren Kultur-pH-Wert als bei einer Konzentration von 20 mM zurückgeführt werden kann, da der pH-Wert immer noch sehr schnell abfiel. Wir haben uns gefragt, ob die beobachteten positiven Effekte auf andere metabolische Ver?nderungen zurückzuführen sind. Unter Verwendung der identischen Versuchsanordnung wiederholten wir die Experimente mit Deep Well OxoDishes?, in der Annahme, dass ?nderungen auf metabolischer Ebene den Sauerstoffverbrauch beeinflussen und sich somit in der Konzentration des gel?sten Sauerstoffs widerspiegeln k?nnten. Die DO-Profile der Kultur sind in Abb. 4A gezeigt. Bemerkenswerterweise hatten die Kontrollkultur und die Kultur, die mit 20 mM Puffer gepuffert war, im Vergleich zu den anderen Kulturen ein sehr ausgepr?gtes Sauerstoffprofil. Nach einem Rückgang des gel?sten Sauerstoffs auf Werte nahe 0 % erreichte Sauerstoff nach 24 Stunden Kultivierung nahezu 50 % Lufts?ttigung. Im Gegensatz dazu war die anf?ngliche starke Abnahme an gel?stem Sauerstoff in den zwei Kulturen mit 40 und 50 mM Phosphatpuffer aufgrund der niedrigeren OD weniger ausgepr?gt. Ein zweiter, intermedi?rer Sauerstoffabfall zeigte eine ?nderung des Substrats an. Der folgende Gleichgewichtszustand zwischen Sauerstoffverbrauch und Sauerstoffeintritt stabilisierte sich leicht über 20 % Lufts?ttigung. Die Kulturen, die 30 mM Phosphatpuffer enthielten, zeigten ein intermedi?res Verhalten, wobei dem schnellen Abfall des gel?sten Sauerstoffgehalts eine Substrat?nderung und ein station?rer Zustand folgten, was gegen Ende der Kultivierung in DO-Werte von etwa 30 % Lufts?ttigung resultierte. Die beobachteten Unterschiede in der Konzentration von gel?stem Sauerstoff wurden von Ver?nderungen beim Verbrauch der Kohlenstoffquelle Raffinose begleitet (4B). Im Fall von Zellen, die in den synthetischen Standardmedien gezüchtet wurden, war der Raffinoseverbrauch am niedrigsten. Galactose, die als Induktor dient, wurde in allen Kulturen vollst?ndig verbraucht. Für die Kulturen mit 30, 40 und 50 mM Phosphatpuffer ist die Ver?nderung des Substratverbrauchs in der DO-Kinetik als zweiter Sauerstoffabfall nach der ersten Erh?hung deutlich zu erkennen.

Die Anwendung von Online-?berwachungssystemen wie Deep Well Oxo- und HydroDishes? ist sehr nützlich, um zus?tzliche Einblicke in die Kulturbedingungen und die Zellphysiologie zu erhalten. Die w?hrend der Studie erzeugten Daten best?tigten wie wichtig die Pufferkapazit?t der Medien ist, um die Produktstabilit?t sicherzustellen. Unerwarteterweise zeigte sich, dass die Pufferkapazit?t der Medien auch die Zellphysiologie beeinflussen kann, was in Ver?nderungen des Sauerstoffverbrauchs und der Substratnutzung beobachtet werden konnte, und neue Forschungsfragen aufwirft.

Referenzen
[1] Nasab, F. P., Aebi, M., Bernhard, G., Frey, A. D. 2013. A combined system to engineer glycosylation efficiency and glycan structure in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol. 79: 997 - 1007
[2] Piirianen, M. A., Boer, H., de Ruijter, J. C., Frey, A. D. 2016. A dual approach for improving homogeneity of human-type N-glycan structure in Saccharomyces cerevisiae. Glycoconjugate Journal 33 (2): 189 - 199
[3] de Ruijter, J. C., Koskela, E. V., and Frey A. D. 2016. Enhancing antibody folding and secretion by tailoring the Saccharomyces cerevisiae endoplasmic reticulum. Microbial Cell Factories. 15:87
[4] de Ruijter, J. C., Jurgens, G., Frey, A. D. 2017. Screening for novel genes of Saccharomyces cerevisiae involved in recobinant antibody production. FEMS Yeast Res. 2017 Jan: 17 (1). fow104