Wirkung der nicht-symbiotischen H?moglobin-Expression auf den Sauerstoffgehalt in Wurzeln

Sauerstoff-Imaging und Respirationsmessungen in Wurzeln mit VisiSens?

Dieses Projekt zielte darauf ab, die Rolle von pflanzlichem nicht-symbiotischem H?moglobin und die Regulierung der Atmung durch Stickstoffoxid in Pflanzenwurzeln zu definieren. Wildtyp- und H?moglobin-überexprimierende Gerstenwurzeln wurden für diese Experimente verwendet. Sauerstoff-Imaging in geschnittenen Wurzeln sowie Atmungsmessungen von Wurzeln in Eppendorf-R?hrchen wurden mit dem VisiSens? System durchgeführt. Frühere Ergebnisse zeigten, dass die Stickstoffmonoxidproduktion in H?moglobin-überexprimierenden Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen reduziert ist. Darüber hinaus hemmt Stickstoffmonoxid die mitochondriale Atmung. In diesen Experimenten zeigten H?moglobin-überexprimierende Wurzeln innere Sauerstoffkonzentrationen von 67 % Lufts?ttigung, w?hrend in den Wildtyp-Wurzeln 85,6 % Lufts?ttigung gemessen werden konnten. Messungen der Wurzelatmung zeigten, dass H?moglobin-überexprimierende Wurzeln eine Respirationsrate von 960 nmol/gfw/h aufwiesen, w?hrend die Wildtypwurzeln eine Respirationsrate von 730 nmol/gfw/h hatten. Dies stimmt mit früheren Befunden überein und zeigt, wie Stickstoffmonoxid die Atmung hemmt und die Sauerstoffhom?ostase erh?ht.

Pflanzliche H?moglobine stellen verschiedene Gruppen von H?mproteinen dar und sind in drei Gruppen unterteilt: Klasse 1 H?moglobine besitzen eine sehr hohe Affinit?t zu Sauerstoff. H?moglobine der Klasse 2 haben eine geringere Sauerstoffaffinit?t und sind an der Pflanzenentwicklung beteiligt. H?moglobine der Klasse 3 sind verkürzt und unterscheiden sich sehr von den H?moglobinen der Klasse 1 und 2. H?moglobine der Klasse 1 fangen Stickstoffmonoxid (NO) ab, das bei sehr niedrigen Sauerstoffniveaus in Pflanzen produziert wird. Stickstoffmonoxid kann auf verschiedenen Wegen erzeugt werden, die in oxidative und reduktive enzymatische Reaktionen unterteilt sind. Die reduktiven Wege arbeiten unter sauerstoffarmen Bedingungen. Nitrat-Reduktase (NR) reduziert Nitrat zu Nitrit und weiter zu NO. Unter niedrigen Sauerstoffbedingungen (weniger als 1 %) reduziert auch die mitochondriale Elektronentransportkette Nitrit zu NO. Das von Mitochondrien stammende NO ist sehr interessant, da es bekanntlich die Pflanzenatmung reguliert. NO bindet an Cytochrom c Oxidase und hemmt die Atmung, wodurch es die innere Sauerstoffkonzentration erh?hen kann. Dies ist sehr wichtig für das kurzzeitige ?berleben von Pflanzen unter z. B. Hochwasserbedingungen. In diesem Projekt wurde untersucht, welche Auswirkungen die nicht-symbiotische H?moglobin-Expression auf die Atmung der Wurzeln und die Sauerstoffkonzentration im Inneren hat, um neue Einblicke in die Rolle von in vivo erzeugtem NO bei der Pflanzenatmung zu erhalten. Das VisiSens? Sauerstoff-Bildgebungssystem wurde zur Visualisierung von Sauerstoffverteilungen in geschnittenen Wurzeln und zur Messung der Atmung von Wurzeln in Eppendorf-R?hrchen eingesetzt. Die planaren Sauerstoffsensorfolien erm?glichten die Integration in verschiedene Anordnungen.

Material & Methoden

Wildtyp- (WT) und H?moglobin-überexprimierende (Hb+) Gerstenpflanzen wurden auf Hydrokulturen gem?? Planchet et al. (2005) gezogen. Die Wurzeln wurden vorsichtig aus den Pflanzen herausgeschnitten und in einen Becher gegeben, der Hydrokulturmedium enthielt. 1 - 2 cm lange Wurzelstücke wurden abgeschnitten und auf einen Objekttr?ger gelegt, der einige Tropfen N?hrl?sung enthielt. Die sauerstoffempfindliche Sensorfolie (SF-RPSU4, PreSens) wurde in 1 x 2 cm gro?e Stücke geschnitten, auf die Wurzeln gelegt und die interne Sauerstoffverteilung mit der VisiSens? Detektoreinheit aufgezeichnet. Zur Messung der Atmung wurden 200 mg der Wurzeln in 1,5 ml Eppendorf-R?hrchen gegeben, die 1 ml HEPES pH 7,2 enthielten. Vor dem Hinzufügen der Wurzeln wurden 0,5 x 0,5 cm gro?e Sensorfolienstücke mit Silikonkleber an den Innenw?nden der Eppendorf-Tubenkappen befestigt. Die Eppendorf-R?hrchen, die mit den Sensoren und den Wurzeln versehen waren, wurden in einen Heizblock gestellt und auf eine Temperatur von 25 °C eingestellt. Die VisiSens? Detektoreinheit wurde mit einem Stativ in 2 cm Abstand von der Sensorfolie fixiert, um die beste Aufl?sung zu erzielen (siehe Abb. 1).

Interner Sauerstoff & Atmung in Wurzeln

Um die Wirkung von in vivo erzeugtem NO auf den inneren Sauerstoffgehalt der Wurzeln zu überprüfen, wurden Wildtyp- und nicht-symbiotisch H?moglobin-überexprimierende Gerstenpflanzen verwendet. Wurzeln von 3 Wochen alten Pflanzen wurden angeschnitten und die Sauerstoffkonzentration wie oben beschrieben gemessen. Die innere Sauerstoffkonzentration von H?moglobin-überexprimierenden Gerstenwurzeln betrug 67 % Lufts?ttigung, w?hrend die Wildtypwurzeln Sauerstoffkonzentrationen von 85,6 % Lufts?ttigung zeigten (siehe Abb. 2). 3D-Sauerstoffdiagramme, die mit der VisiSens AnalytiCal 1 Software erstellt wurden, zeigen deutlich die Sauerstoffkonzentrationen im Wurzelgewebe (Abb. 3). Die Ergebnisse eines derzeit laufenden Projekts (hier nicht gezeigt) zeigen, dass in Wildtyp-Pflanzen mehr Stickstoffmonoxid (NO) vorhanden ist, w?hrend in H?moglobin-überexprimierenden Pflanzen die NO-Produktion im Vergleich zum Wildtyp auf 30 % reduziert ist. NO hemmt die mitochondriale Atmung. Durch die Hemmung der Atmung kann NO die Sauerstoffverfügbarkeit in den Wurzeln erh?hen. Dies muss die zunehmende interne Sauerstoffkonzentration der Wildtypwurzeln im Vergleich zu den H?moglobin-überexprimierenden Wurzeln erkl?ren. Um die Wirkung der inneren Sauerstoffkonzentration auf die Wurzelatmung zu überprüfen, wurde die Respiration von Wildtyp- und H?moglobin-überexprimierenden Wurzeln in einer 20-minütigen Zeitreihe mit VisiSens? gemessen. Interessanterweise betrug die Respirationsrate von H?moglobin-überexprimierenden Wurzeln 960 mmol/gfw/h (siehe auch Abb. 4), w?hrend in den Wildtyp-Wurzeln die Respirationsrate bei 730 mmol/gfw/h lag. Dies zeigt deutlich, dass Stickstoffmonoxid die Atmung hemmt und die Sauerstoff-Hom?ostase in den Wurzeln erh?ht.

Zusammenfassung

Die Ergebnisse in diesen Experimenten stimmen mit früheren Ergebnissen bezüglich der NO-Produktion und ihrer hemmenden Wirkung auf die Pflanzenatmung überein. Mit dem VisiSens? System war es m?glich, Sauerstoffverteilungen in abgeschnittenen Wurzeln von Wildtyp und H?moglobin-überexprimierender Gerste sichtbar zu machen. Das Sauerstoffbildgebungssystem erlaubte auch Atmungsmessungen. Die planaren Sensorfolien, die in jede gewünschte Form geschnitten werden k?nnen, erm?glichen es, das System in verschiedenen Aufbauten anzuwenden. Die Flexibilit?t und einfache Steuerung erm?glichen pr?zise Sauerstoffmessungen. Die Ergebnisse werden zum laufenden Projekt beitragen und weitere Einblicke in regulatorische Prozesse in Pflanzen geben.