Zellsauerstoffverbrauch in Mikrofluidikvorrichtungen

?berwachung der Sauerstoffspannung mit dem VisiSens-System

Wir haben Mikrofluidikvorrichtungen, die aus Cycloolefin-Copolymer (COC) und Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt wurden, mit VisiSens-Sensorfolien kombiniert, um eine ?berwachung der Sauerstoffspannung in den Vorrichtungen zu erm?glichen. Der Sauerstoffverbrauch von mikrovaskul?ren Endothelzellen aus Rattenlungen (EC) und Rattenhepatozyten (Hep) wurde numerisch simuliert und experimentell unter Verwendung des VisiSens-Aufbaus validiert. Das VisiSens-System erlaubte die Bestimmung des Sauerstoffgehalts in den Mikrofluidikvorrichtungen, sodass geeignete Chip-Materialien - je nach Anwendung und verwendeter Zelllinie – empfohlen werden k?nnen. Darüber hinaus wurde ein zuvor charakterisierter mikrofluidischer Hypoxie-Chip evaluiert, wobei VisiSens im Vergleich zu ?hnlichen Produkten überlegene Sensorik-Eigenschaften zeigte.

Hochdurchsatz-COC- und PDMS-Chips, mit einer langen Gelregion und angrenzenden, separaten Medienkan?len, wurden entworfen und hergestellt. Ein neuartiger Hypoxie-Chip, der auf PDMS basiert, wurde ebenfalls getestet. Dieser Chip besteht aus einem zentralen Gelbereich, der von verbundenen Medienkan?len und peripheren Gaskan?len flankiert ist, wobei die Gaskan?le durch eine dünne sauerstoffdurchl?ssige PDMS-Membran physisch von den Medienkan?len getrennt sind. Direktes Verbinden der unbehandelten Sensorfolien (SF-RPSU4, PreSens) mit den Chips erzeugte mechanisch instabile Konstrukte oder schlecht versiegelte Vorrichtungen. Es wurde beschlossen, eine dünne Schicht (30 μm) PDMS durch Spin-Coating auf Sensorfolien mit entfernter Schutzbeschichtung aufzutragen, da PDMS bekannterma?en gut sowohl an PDMS als auch an COC bindet. Die PDMS-beschichteten Folien wurden dann irreversibel mit aktivierten COC- und Plasma-behandelten PDMS-Chips verbunden, wodurch die mikrofluidischen Kan?le gut abgedichtet waren. Die Funktionalit?t der Sensorfolien wurde nach PDMS-Beschichtung, H?rtung und Plasmabehandlung überprüft und es wurde kein signifikanter Leistungsunterschied im Vergleich zu unbehandelten Folien festgestellt. Um die Zelladh?sion zu erleichtern, wurden die Vorrichtungen dann mit Poly-D-Lysin (1 mg/ml in dH₂0) beschichtet. Ein 2,5 mg/ml Typ-I-Kollagengel wurde in die Gelregion der Chips eingebracht. Unmittelbar vor dem Auss?en der Zellen wurden die Medienkan?le für 4 Stunden mit einer 50 ng/ml w?ssrigen L?sung von Fibronectin gefüllt. In der vorliegenden Studie wurden mikrovaskul?re Rattenendothelzellen (EC) und Rattenhepatozyten (Hep) verwendet. Beide Zelltypen wurden in den Medienkan?len der Chips mit einer Dichte von 4 M Zellen/ml ausges?t und für 30 Minuten stehengelassen, damit sie sich festsetzen konnten. Unbefestigte Zellen wurden dann mit frischem Medium ausgewaschen und die Vorrichtungen für die angegebenen Zeitr?ume in einem variablen Inkubator (5% CO₂, 37 °C) kultiviert. Der Sauerstoffverbrauch in den Vorrichtungen in Gegenwart von EC- und Hep-Zellen wurde ebenfalls unter Verwendung kommerzieller Finite-Elemente-Software (COMSOL Multiphysics v4) simuliert. Alle Messungen wurden mit der VisiSens AnalytiCal 1 Software ausgewertet.

Der neuartige Mikrofluidik-Chip, der in der Lage ist, einheitliche oder hypoxische Gradientenzust?nde über einer zentralen Zellregion zu etablieren, wurde getestet, um die VisiSens-Technologie mit anderen Sauerstoffsensoren zu vergleichen. Der Hypoxie-Chip war mit Kollagen und Wasser gefüllt. Eine On-Chip-Kalibrierung wurde erreicht, indem zeitweilig eine luftges?ttigte und eine sauerstofffreie (Sulfit-)L?sung in die Gaskan?le gepumpt wurde. Anschlie?end wurden die Gaskan?le mit Stickstoffgas durchspült, um einheitlich hypoxische Bedingungen zu schaffen. Die Sauerstoffkonzentration im Gelbereich wurde über die Zeit gemessen (Abb. 2 B). Die Sauerstoffspannung senkte sich innerhalb von 1,5 h auf 3 % und innerhalb von 4 h auf 1 % ab. Im Vergleich zu früheren Daten stimmt dieses Ergebnis besser mit den numerischen Simulationsdaten überein (3 % nach einer Stunde), was das Potenzial des VisiSens-Systems für die Anwendung in Mikrofluidiken aufzeigt. Dann wurde der Hypoxie-Chip mit sauerstofffreier (Sulfit-)L?sung gefüllt und Luft wurde durch die Gaskan?le geleitet, um den umgekehrten Effekt zu demonstrieren. Abbildung 2 C zeigt die Reoxygenierung der zentralen Gelregion von 1 % Hypoxie auf 21 % O₂ nach ca. 1 Stunde. Sauerstoffgradienten konnten ebenfalls mit VisiSens ermittelt und ausgewertet werden.

Vor der Auswertung wurde der Sauerstoffverbrauch von Hep und EC sowohl in COC- als auch in PDMS-Chips simuliert (Abb. 3). Für die Modellierung wurde die gleiche Zellaussaatdichte wie bei der experimentellen Validierung verwendet. Die Simulationsergebnisse zeigen, dass für Hep im COC-Chip eine Sauerstofflimitierung wahrscheinlich ist (0 % nach 0,5 h), ein hoher Verbrauch für EC in COC zu erwarten ist (6 % nach 2 h) und von normalen Sauerstoffwerten für Hep und EC in PDMS (21 %) ausgegangen werden kann. Beide Zelllinien wurden unabh?ngig voneinander in Mikrofluidik-Chips ausges?t, über 2 Tage kultiviert, und ihr Sauerstoffverbrauch mit dem VisiSens-System überwacht, bis sich ein Gleichgewichtszustand eingestellt hatte. Hepatozyten zeigten einen hohen Sauerstoffverbrauch und verbrauchten nahezu den gesamten Sauerstoff innerhalb des undurchl?ssigen COC-Chips innerhalb von 1 h (3 %, Fig. 4 A - C), was mit den Simulationsergebnissen vergleichbar ist. In dünnen PDMS-Chips kann Sauerstoff aus der Umgebung eindringen, was zu einer Stabilisierung des Sauerstoffgehalts zwischen 15 und 17 % innerhalb von 4 Stunden führte (Abb. 4 D - F). Diese Ergebnisse unterscheiden sich signifikant von den simulierten Werten, was auf konservative Simulationsparametern zurückzuführen sein k?nnen. Diese Daten legen nahe, dass COC-Vorrichtungen für eine hypoxische Zellkultur von Hepatozyten geeignet sind, w?hrend PDMS-Vorrichtungen mit definierter Dicke gew?hlt werden sollten, wenn ein intermedi?rer Sauerstoffgehalt der Kultur erwünscht ist. Für ECs wurde nur ein m??iger Sauerstoffverbrauch erwartet, was sowohl durch die Simulationen als auch experimentelle Daten best?tigt wurde, die in Zellkulturen in Chips mit Sensorfolie gemessen wurden. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen COC (stabil um 21 - 19 %) und PDMS (21 %) beobachtet und beide Materialien k?nnen daher für die normoxische Kultur dieser Zelllinie als geeignet angesehen werden.

Zusammenfassung

Ein zuvor charakterisierter mikrofluidischer Hypoxie-Chip konnte erfolgreich evaluiert werden, und das VisiSens-System zeigte im Vergleich zu ?hnlichen Produkten überlegene sensorische F?higkeiten. Die Biokompatibilit?t und nicht-invasive Arbeitsweise der VisiSens-Sensorfolien erm?glichte auch die Bestimmung des Sauerstoffgehalts in mikrofluidischen Zellkulturen, und erlaubt es je nach verwendeter Zelllinie geeignete Chip-Materialien (COC oder PDMS) zu empfehlen. Mikrofluidikvorrichtungen, die mit Sauerstoffsensoren ausgestattet sind, sind vielversprechende Kandidaten für Screening-Studien und hypoxische Zellkulturanwendungen.